【关键词】肝炎病毒, 丙型； T淋巴细胞，细胞毒性； 多表位疫苗； 设计 Forecasting of hepatitis C virus CTL epitopes and design of multi-epitopes vaccine LI Duan, XIE Yu-wei, XUE Xiao-ping, BAI Xue-fan, JIA Zhan-sheng. 【Key words】Hepatitis C virus; T-lymphocytes, cytotoxic; Multi-epitope vaccine; Design 【First author’s address】Center of Diagnosis and Treatment for Infectious Diseases of Chinese PLA, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi抋n 710038, China Corresponding author: JIA Zhan-sheng, Email: jiazsh@fmmu.edu.cn 寻求抗HCV疫苗和有效抗病毒药物的探索一直是研究的热点[1]。我们应用生物信息学方法，选择HCV 核心（C）区、NS3、NS4、NS5等各区的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位，进行优势组合，结合中国人人类白细胞抗原（HLA）的频率，设计、合成重组HCV多表位疫苗的基因序列，以达到对CTL表位初步筛选，提高实验成功率的目的，同时为构建多个CTL表位疫苗提供理论依据，为今后HCV疫苗的研究开发积累一定的实践经验。 一、材料与方法 1. HCV蛋白质组数据库建立：以关键词：organism:“hepatitis c virus”AND name:“genome polyprotein”AND fragment:no AND reviewed:yes搜索uniprot蛋白质数据库（http://beta.uniprot.org/），选择中国流行的HCV 基因型为1b、 2. HCV多聚蛋白蛋白酶体剪切预测：采用PepCleave （http://peptibase.cs.biu.ac.il/PepCleave_II/）预测蛋白质序列可能的蛋白酶水解九肽，选用bad overweight score打分矩阵。预测的可能蛋白酶体水解（分值>0）九肽。编写perl语言脚本处理PepCleave结果输出序列，仅保留九肽部分序列，并保存成fasta格式序列文件。通过Blast比对，去除同源性100%序列。 3. TAP结合力预测：将上述蛋白酶体水解九肽，通过PREDTAP（http://antigen.i2r.a-star.edu.sg/predTAP/）软件隐马尔可夫模型（Hidden Markov Models method，HMM）计算筛选出的九肽与TAP结合能力，获取其中TAP结合评分高分值九肽。 4. 与HLA分子亲和力计算：根据文献[2]，在本研究中采用覆盖大多数中国人HLA等位基因，分别为HLA A2（A*0201、A*0205）、A3（A*3、A*1101、A*3302）、A24(A*24)、B44、B44（B*40）五种超型可能的CTL表位肽。采用BIMAS（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/）分别预测候选九肽与HLA 5. 初步确定肽段：分别统计HLA 6. 多肽疫苗构建：采用上述选择CTL表位九肽构建多肽疫苗，并作蛋白酶体剪切校验。保证多肽疫苗通过蛋白酶体剪切后，各CTL表位肽能够得以还原，并经MHC分子提呈，进行后续免疫反应。 二、结果 1. 建立HCV蛋白质组数据库：选择中国流行的HCV 基因型为1b、 2. HCV多聚蛋白蛋白酶体剪切及TAP结合力预测结果：17株HCV蛋白质组可形成51799条九肽单体，采用PepCleave预测的可能蛋白酶体水解（分值>0）九肽共有8347个，其中不同位置不同病毒株的非重复九肽达4075条。通过Blast比对，去除同源性100%的序列，剩余3789条蛋白酶体可能水解九肽。计算3789条与TAP结合能力，获取其中TAP结合评分值大于等于6的九肽共514条。 3. 与HLA分子亲和力计算并初步确定肽段：选取结合评分大于1的九肽，计算结果略。在候选CTL表位过程中，综合考虑九肽综合得分、覆盖的病毒基因型、病毒株占本研究中HCV数据库的比例，及该九肽对于不同HLA 分子（超型）的预测结合能力，初步选择12条CTL表位，见表2。 4. 多肽疫苗构建结果：采用上述选择CTL表位九肽构建多肽疫苗，并作蛋白酶体剪切校验。保证多肽疫苗通过蛋白酶体剪切后，各CTL表位肽能够得以还原，并经MHC分子提呈，进行后续免疫反应。由于CTL候选表位肽经蛋白酶体剪切预测筛选，因此在多肽疫苗构建过程中，没有考虑链接肽。构建多肽疫苗序列为：FLARLIWWL-VLSDFKVWL-ALYDVIQKL-ALYDVVSTL-SMMAFSAAL-ALYGVWPLL-AALENLVVL-AAWYIKGRL-GAAVGSIGL-AEQFKQKAL-AYAARVPEL-GLSPAITKY。原构建性CTL表位在该多肽疫苗经蛋白酶体剪切后全部得以还原，且均为优势剪切（剪切分值高）。 三、讨论 重组多表位疫苗已在肿瘤疫苗、HIV疫苗和HCV疫苗的研究方面进行了探索，显示其在诱导细胞免疫反应方面具有独特的优势[3-4]。 为了诱导出针对多个HCV表位的特异性细胞免疫反应，选择HCV基因组中不同区的多表位，进行科学设计、合理组合是目前HCV疫苗开发研究的热点。越来越多的证据表明，要获得具有较强免疫原性的HCV多肽，广泛地激发机体的CD8+ T淋巴细胞介导的免疫反应，必须具有HCV不同区段的多个表位[5]。选择HCV抗原表位的覆盖面对诱导细胞免疫反应的强度和广度以及在病毒清除中起着重要作用[6]。同时，细胞免疫反应时，免疫原在抗原提呈细胞内都要经过一个复杂的加工及由主要组织相容性抗原提呈的过程，其Ⅰ类提呈能激活CD8+ T细胞的抗原表位[7]。因此，在多表位疫苗的设计中还要考虑所选择的表位必须要能覆盖不同人群的HLA限制型，才能使疫苗对绝大多数个体都有作用。 本研究旨在寻找能覆盖绝大多数中国人群的HLA限制型的HCV CTL抗原表位，为适合中国人使用的HCV多表位疫苗抗病毒的研究提供重要理论依据。我们获得了HCV多表位基因序列，该序列由108aa组成，含有12个CD8+ CTL表位，涵盖中国人HLA-Ⅰ类基因座等位基因频率较高的抗原表位，并包括HCV基因不同区的多个CD8+ CTL表位。 CTL是抗病毒免疫的主要效应细胞，抗原中的CTL表位疫苗在所有抗病毒治疗性疫苗中特异性是最强的[8]。而理想的CTL表位预测方法可使待选多肽范围缩小，再用相应实验来鉴定，可以使鉴定过程大大简化，同时提高表位鉴定的准确率，这不仅可以促进我们对CD8+ T细胞免疫识别机制的深入认识，也为基于CTL表位的多肽或基因疫苗研制开辟了广阔的空间。该HCV CTL多表位疫苗的确认还有待CTL杀伤实验及小鼠体内免疫保护及免疫治疗实验来证明。 参 考 文 献 [1]Webster DP, Klenerman P, Collier J, et al. Development of novel treatments for hepatitis C. Lancet Infect Dis, 2009, 9: 108-117. [2]Xue FZ, Wang JZ, Hu P, et al. Forecasting system on spatial coverage of cumulative phenotypic frequency of HLA class I for designing HLA-based vaccines in China. Mianyixue Zazhi, 2005, 21: 136-141. (in Chinese) 薛付忠,王洁贞,胡平,等.中国多表位疫苗设计的HLA-Ⅰ积累表型频率空间预测系统.免疫学杂志,2005,21:136-141. [3]Soler E, Houdebine LM. Preparation of recombinant vaccines. Biotechnol Annu Rev, 2007, 13: 65-94. [4]Hurwitz JL, Zhan X, Brown SA, et al. HIV-1 vaccine development: tackling virus diversity with a multi-envelope cocktail. Front Biosci, 2008, 13: 609-620. [5]Stoll-Keller F, Barth H, Fafi-Kremer S, et al. Development of hepatitis C virus vaccines: challenges and progress. Expert Rev Vaccines,2009, 8: 333-345. [6]Encke J, Radunz W, Eisenbach C, et al. Development of a heterologous, multigenotype vaccine against hepatitis C virus infection. Eur J Clin Invest, 2007, 37: 396-406. [7]Azizi A, Diaz-Mitoma F. Viral peptide immunogens: current challenges and opportunities. J Pept Sci, 2007, 13: 776-786. [8]Shi L, Liu S, Fan GX, et al. Effective induction of type 1 cytotoxic T cell responses in mice with DNA vaccine encoding two hepatitis C virus cytotoxic T lymphocyte epitopes. Viral Immunol, 2006, 19: 702-711.
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