SOM230促进HepG2细胞原位移植瘤坏死的机制

【摘要】目的  观察一种新合成的生长抑素类似物SOM230对肝癌细胞株HepG2体外、体内生长的影响，探索非细胞毒性药物导致肝癌坏死的可能机制。 方法  采用四甲基偶氮唑盐法、末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（TUNEL）及流式细胞技术检测SOM230对体外培养的肝癌细胞HepG2生长及凋亡的作用。用肝癌细胞株HepG2建立裸鼠肝癌原位移植瘤模型，分为SOM230组（100μg·kg-1·d-1皮下注射）及对照组（等量等渗盐水皮下注射），连续用药8周，测定移植瘤坏死体积。Western blot测定肿瘤组织中生长抑素受体2（SSTR2）的表达水平；免疫组织化学显示肿瘤组织中血管内皮生长因子（VEGF）、SSTR2的表达部位；酶联免疫吸附法检测移植瘤组织中肿瘤坏死因子α（TNFα）含量。两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。 结果  SOM230在体外对HepG2细胞增殖有一定的抑制作用，IC50为2.73×10-6mol/L，对其凋亡无明显影响（TUNEL实验F＝0.16，P＞0.05；Annexin-V实验F＝0.13, P＞0.05）。SOM230组的移植瘤坏死体积为73.4%±7.0%，明显高于对照组的30.2%±14.0%（t＝-8.02，P<0.01）。两组移植瘤的血窦中均有SSTR2阳性染色，表达水平差异无统计学意义；SOM230组肝癌移植瘤组织中的VEGF表达为阴性，但移植瘤内TNFα水平在两组的差异无统计学意义［SOM230组与对照组，（10.3±8.0）ng/ml与（9.2±5.8）ng/ml，t＝-0.24，P＞0.05）］。 结论  SOM230通过SSTR2介导，显著下调肝癌组织VEGF的表达水平，仅阻断生长旺盛肿瘤的血供，导致肝癌移植瘤明显坏死。

【关键词】癌，肝细胞； 肿瘤移植;  生长抑制物； 坏死

Induction of necrosis in the hepatocellular carcinoma HepG2 xenografts treated with SOM230    XIE Yan*, CHEN Shuang, WANG Chun-hui, TANG Cheng-wei. *Department of Gastroenterology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China

Corresponding author: TANG Cheng-wei, Email: cwtang@medmail.com.cn

【Abstract】 Objective    To investigate the effects of SOM230, a new somatostatin analogue, on the proliferation of hepatocellular carcinoma (HCC) cell line HepG2 in vitro and in vivo, and explore the mechanism underline the necrosis of tumors. Methods    MTT, TdT-mediated dUTP nick end labeling assay (TUNEL) and flow cytometric assay were used to measure the effects of SOM230 on the proliferation and apoptosis of HCC HepG2 cells. Nude mice bearing HCC xenografts of the HepG2 cell line were treated with SOM230 (100μg . kg-1 . d-1 subcutaneously injection) and saline as a control for eight weeks. The mass and percentage of necrotic volume of the HCC xenografts in nude mice were determined. Western blot was used to detect SSTR2 in HCC xenografts. Immunohistochemical method was used to detect the expression sites of SSTR2 and VEGF in HCC xenografts. ELISA was used to detect the levels of TNFα. Results    No proliferation and apoptosis of HepG2 cells were induced by SOM230 in vitro (F = 0.16, P > 0.05). The percentage of necrotic volume in SOM230 were significantly higher than that of control group (73.4%±7.0% vs 30.2%±14.0%, t = -8.02, P < 0.01). SSTR2 was expressed in blood sinus of HCC xenografts in nude mice. There was no significance difference in the level of SSTR2 expression between SOM230 group and saline treated group. VEGF expression in xenografts was down-regulated by SOM230 treatment. SOM230 treatment did not affect the level of TNFα in HCC xenografts[t = -0.24, P > 0.05]. Conclusions    SOM230 can induce massive necrosis of HCC xenografts only after the blockage of blood flow through down-regulation of VEGF mediated by SSTR2.

【Key words】Carcinoma, hepatocellular;  Neoplasm transplantation;  Growth inhibitors;   Necrosis

80%的肝细胞肝癌（HCC）患者一经诊断已属晚期，迄今为止，晚期HCC患者尚无有效药物治疗[1]。自从1998年希腊学者首次报道生长抑素类似物（somatostatin analogue，SSTA）奥曲肽（octreotide）能改善晚期HCC患者生存质量并延长生存期后，有关奥曲肽等SSTA治疗HCC的实验及临床研究已有较多报道[2-4]。SSTA通过HCC的生长抑素受体（somatostatin receptor，SSTR）介导，抑制肿瘤生长。SSTR2激活后，一方面通过磷酸酪氨酸磷酸酶抗有丝分裂、抑制肿瘤细胞增殖，另一方面以依赖Src同源磷酸酶-1的方式诱导肿瘤细胞凋亡[5]。人类肝癌组织或细胞株中可检测到一种或多种SSTR亚型，阳性率为41%～75%[6-7]。自奥曲肽成功用于临床后，多种SSTA如兰瑞肽（lanreotide，BIM 23014）、伐普肽（vapreotide, RC-160）[8]等相继问市，这些SSTA主要通过与SSTR2结合而发挥作用。SOM230（pasireotide）是近年新合成的一种结构更稳定的环己肽，其皮下注射剂型在大鼠在体实验中血浆半衰期约为23h，是新一代的SSTA，与SSTR1～3和SSTR5共4种SSTR亚型具有较高亲和力[9]。研究表明，SOM230对转移性癌、肢端肥大症和Cushing病患者治疗有效[10]；但对HCC的疗效如何，尚鲜见报道。本研究观察了SOM230B（皮下注射剂型）在体外及体内对肝癌细胞株HepG2的作用，并初步分析其作用机制。

材料与方法

1. 材料: 人HCC细胞株HepG2为本室保存。BALB/c nu/nu裸鼠，无特殊病原级，雄性，6～7周龄，体质量20～30g，购自四川大学华西医学中心动物实验中心，动物合格证号为SCXK(川)-09-2006。SOM230B（皮下注射剂型）原药粉剂由诺华制药有限公司赠送；新生小牛血清购自成都哈里生物工程有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂、末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（TUNEL）试剂盒购自上海Roche公司；Annexin-Ⅴ-异硫氰酸荧光素（FITC）购自南京凯基生物科技发展有限公司；RPMI 1640干粉购自北京Hyclone生物化学制品有限公司。SSTR2山羊抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz 生物工程公司，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）兔抗人多克隆抗体及SP9003三步法免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2. 细胞培养: HepG2细胞常规培养于含体积分数10%新生小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的RPMI 1640培养液中。培养条件为37℃、5% CO2饱和湿度，1～2d用0.25%胰酶消化传代。

3. MTT实验: 用0.25%胰酶消化单层培养细胞，以每孔1×103～1×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200μl。将不同浓度的SOM230加入培养孔内，各组终浓度分别为1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L，每一浓度设3个复孔，未加入任何药物的作为对照组。按MTT实验步骤操作，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(A)值，记录结果。实验重复3次，取平均值。以药物浓度为横轴、A值为纵轴绘制细胞生长曲线。计算细胞生长抑制率=(对照组A值-实验组A值)／对照组A值×100%。

4. TUNEL试验: 按2.5×104个/孔的浓度将HepG2细胞接种于预置小破片的24孔板，SOM230组每孔加入药物终浓度为 1×10-7、1×10-5mol/L；对照组加入等体积培养液，每孔总体积为1ml。孵育24h，加入TUNEL反应混合液，制成HepG2细胞爬片，按TUNEL试剂盒说明书操作。在400倍光学显微镜下随机选取5个阳性细胞数（细胞核中有棕黄色颗粒者）较多的视野，计算100个肝癌细胞中阳性细胞所占的百分比，取平均值为凋亡指数。

5. 流式细胞仪检测Annexin-V/碘化丙啶（PI）双染色早期凋亡细胞:  取对数生长期的HepG2细胞，按2.5×105个/孔接种于6孔板，换为无血清培养液培养24h；每孔分别加入SOM230 1×10-7、1×10-5mol/L，干预24h，按照Annexin-Ⅴ-FITC/PI双染色试剂盒说明书操作，送流式细胞仪检测。

6. 肝癌原位移植瘤模型：取对数生长期的HepG2细胞，将1×106个细胞接种于BALB/c nu/nu裸鼠前腋皮下。4周后肿瘤生长至直径2.0～2.5cm，完整取下肿瘤块，立即浸入含青霉素、链霉素各100U/ml的等渗盐水中，切成2mm×2mm×2mm大小的肿瘤块备用。常规消毒皮肤，用戊巴比妥钠按50mg/kg腹腔注射麻醉裸鼠。取腹正中切口进腹，暴露肝脏，将肝左叶提出腹腔，用眼科剪刺一斜行切口，将瘤块放入；凝胶海绵加压止血后，将肝左叶轻轻放回腹腔，观察肝脏及腹腔无明显出血后逐层关腹。

7. 裸鼠体内实验：瘤块移植术后的裸鼠被随机分为SOM230组及对照组，每组8只。SOM230溶解于等渗盐水中，10μg/ml，无菌保存于4℃备用。SOM230组裸鼠皮下注射SOM230 100μg·kg-1·d-1，对照组则皮下注射等量等渗盐水，连续用药8周。瘤块移植术后第2天开始给药，给药期间注意观察裸鼠的食欲、精神状态及活动情况。末次用药24h后抽取鼠尾动脉血，检查总胆红素（TBil）、ALT、AST、白蛋白（Alb）等肝功能指标；处死动物，取出完整肿瘤，称质量后将标本用4%多聚甲醛固定，连续石蜡切片，评价组织学改变。并计算每张切片坏死组织的面积，在此基础上获得肿瘤坏死体积的百分数。

8. Western blot测定肿瘤组织中SSTR2的表达: 称取肿瘤组织100～200mg，按照核蛋白质和胞质蛋白质提取试剂盒（购自南京凯基生物科技发展公司）说明书操作，提取各标本的总蛋白质；所有样本均用BCA蛋白质定量测定试剂盒（购自美国Pierce公司 ）完成蛋白质定量。每孔上样40μg蛋白质，恒流1h将蛋白质从胶转至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene difluoride membrane，PVDF膜，购自美国Millipore公司）。用含5%脱脂牛奶的TBST（Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20）4℃封闭PVDF膜过夜。分别用TBST稀释的β-肌动蛋白（购自美国Santa Cruz公司，1∶1000稀释）、SSTR2第一抗体（购自美国Novus公司，1∶750）室温孵育PVDF膜1h。用TBST稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔第二抗体（购自美国Cell Signaling公司，1∶2000稀释）室温孵育PVDF膜1h。曝光显影后，扫描，分析条带。

9. 免疫组织化学法测定肿瘤组织中VEGF、SSTR2的表达：将常规石蜡包埋的肿瘤组织连续切片，厚5μm，脱蜡水化，0.01mol/L柠檬酸溶液高压修复5min，按SP9003三步法免疫组织化学试剂盒说明书进行免疫染色。VEGF、SSTR2第一抗体工作液浓度为1∶200，4℃孵育过夜；二氨基联苯胺（DAB）染色，以棕褐色为阳性染色。SSTR2阳性结果判断：阳性细胞为胞质、胞膜上有棕褐色的颗粒物质表达。

10. 酶联免疫吸附法（ELISA）检测裸鼠种植瘤组织中肿瘤坏死因子α（TNFα）含量：称取裸鼠移植瘤组织100～200mg，每100mg组织加入0.3ml等渗盐水，剪碎后超声匀浆；4℃ 15000r/min离心30min，取上清液，测定蛋白质浓度后-70℃冻存备用。按TNFα的ELISA试剂盒说明书进行检测。

11. 统计学分析：所有数据用均数±标准差（x-±s）表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析；使用SPSS16.0 软件分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. SOM230对HepG2细胞增殖的抑制作用：MTT实验显示，当SOM230浓度为1×10-8～1×10-5mol/L时，细胞吸光度值与剂量呈负相关性，r＝-0.93, P<0.01。对照组细胞的吸光度值在每次检测时无明显改变，一直维持在约0.3的水平。见图1。SOM230对HepG2细胞的IC50值为2.73×10-6mol/L。

2. SOM230不诱导HepG2细胞凋亡：TUNEL实验表明，HepG2细胞经SOM230 1×10-7mol/L和1×10-5mol/L作用24h后，光学显微镜下虽可见少许散在分布、核染成棕黄色的凋亡细胞（图2）；凋亡指数分别为：1.40%±1.14%和1.60%±1.34%，与对照组的凋亡指数（1.20%±0.84%）比较，差异无统计学意义（F＝0.16, P＞0.05)。早期凋亡率（Annexin-V阳性PI阴性）分别为3.2%±2.8%、4.5%±3.4%，与对照组（3.5%±3.6%）比较，差异无统计学意义（F＝0.13，P＞0.05），见图2。表明1×10-7 mol/L和1×10-5 mol/L的SOM230作用HepG2细胞24h后无明显诱导早期凋亡的现象。

3. SOM230促进裸鼠肝癌移植瘤的坏死：所有肝癌原位移植瘤裸鼠均存活且移植瘤生长迅速，用药8周后，SOM230组有2只死亡，对照组有4只（50%）死亡。裸鼠肝癌原位移植瘤体呈圆形或椭圆形，部分肿瘤表面有结节，SOM230组平均瘤质量为（5.27±2.72）g，对照组平均瘤质量为（3.39±2.64）g，两组比较，差异无统计学意义（t＝1.40，P＞0.05）。

切开所有裸鼠肝癌原位移植瘤，对照组肿瘤中心仅有少量坏死区域（30.2%±14.0%），整个肿瘤组织大部分呈透明鱼肉样；SOM230组肿瘤中心有干酪样坏死灶（73.4%±7.0%），坏死体积明显大于对照组（t＝-8.02，P<0.01），且有空洞形成，仅移植瘤边缘有少量鱼肉样组织（图3）。

两组肉眼所见的鱼肉样组织，在显微镜下均呈典型的肿瘤细胞及组织学特征，组织分化程度无明显差异。两组肉眼所见的坏死灶在镜下呈大片均质红染，无明显的细胞结构。在坏死和正常肿瘤组织之间未发现明显的炎症细胞浸润。见图3。

4. 肿瘤组织内VEGF的表达情况：SOM230组6个肿瘤组织内VEGF表达全为阴性；在对照组4个肿瘤中，3个肿瘤组织内较易发现VEGF阳性细胞，胞质被染为棕色（图4）。

5. 肿瘤组织内SSTR2及TNFα的表达水平：Western blot在两组肿瘤组织中均检测到SSTR2的表达，其表达水平相近；免疫组织化学染色显示，SSTR2阳性表达主要在肝癌细胞周围间隙而非细胞表面（图5）。ELISA检测结果表明，SOM230组肿瘤组织内TNFα水平与对照组比较，无明显降低（表1）。

6. SOM230对裸鼠肝功能及一般情况的影响：治疗8周时，SOM230组裸鼠的各项肝功能指标与对照组相比，差异无统计学意义（表1）。治疗期间两组裸鼠进食量、精神状态及活动情况也基本相同。

讨    论

天然生长抑素为14肽或28肽，对SSTR1～5五种受体都具有很强的亲和力，对人体包括生长激素、胰岛素、胃泌素在内的多种激素具有抑制作用，但由于其半衰期不到3分钟，需要持续输入，从而限制其临床应用。目前应用于临床、人工合成的短效SSTA奥曲肽半衰期为2h（大鼠实验，皮下注射剂型），主要与SSTR2亲和力高，与SSTR3、5亲和力稍低，与SSTR1、4几乎没有亲和力[9]。SOM230是一种新合成的环己肽SSTA，半衰期更长，达到23h（大鼠实验，皮下注射剂型），与除SSTR4外的其他4种SSTR都有亲和力，与SSTA1、5的亲和力是奥曲肽的30～40倍。已有研究表明SOM230可明显抑制体外培养的大鼠垂体细胞释放生长激素及胰岛素样生长因子-Ⅰ，其效能是奥曲肽的3倍[9]。

本研究结果显示，浓度为1×10-8～1×10-5mol/L时，SOM230对体外培养的HCC细胞株HepG2增殖虽呈明显的抑制作用，但IC50值为2.73×10-6mol/L，以如此高浓度产生的细胞增殖抑制效应很难说明是其经SSTR介导发生的，尚不能排除SOM230本身的理化特点所致。在体外实验中，反映细胞不同时期细胞凋亡的TUNEL及Annexin-V实验，也未见SOM230作用的阳性结果。将HepG2细胞种植于裸鼠肝内，采用Western blot方法测得在HepG2细胞移植瘤中有SSTR2表达。但进一步的免疫组织化学结果显示，SSTR2主要散在分布于肝细胞周围间隙，而非细胞表面。SSTA主要通过SSTR介导起作用的这一结果解释了细胞学实验中SOM230对HepG2细胞无特异性直接作用的原因。

大多数移植瘤实验是通过瘤质量或肿瘤体积来评价药物的效果，这适宜于非坏死性抗肿瘤效果评价。在本研究中，SOM230组移植瘤质量虽高于对照组，但差异无统计学意义。重要的是，73.4%的肿瘤为坏死灶，而对照组坏死灶仅为肿瘤体积的30.2%，表明体内抗肿瘤效应明显优于对照组。因此，评价坏死性抗肿瘤效果应比较其坏死体积而非瘤质量或肿瘤体积。HCC是血供丰富的肿瘤，其不规则内径、缺乏内皮细胞和完整基底膜的血窦在肿瘤的生长和转移中具有重要作用[11]。肿瘤血管的生成与VEGF诱导有关，VEGF的单克隆抗体能在体内实验中抑制肝癌生长[12]。本研究结果表明：HepG2细胞在体内成瘤后，肿瘤组织中未能见到正常的血管结构，但可见围绕细胞生长、密集分布的血窦，有丰富的VEGF表达。使用SOM230后，裸鼠HCC移植瘤的VEGF表达由阳性转为阴性，明显减少肝癌移植瘤的血供。由于SOM230不影响肝癌移植瘤的生长，蓬勃生长的肿瘤需要丰富的血供，SOM230恰好阻断血管生成，肿瘤生长得不到必要的营养供应，导致肿瘤大面积坏死，肿瘤负荷得以有效降低。

TNF是一种能使移植肿瘤发生出血、坏死的物质，它在体内、外对多种肿瘤细胞有特异性杀伤作用[13]。TNF通过与肿瘤细胞表面的TNF受体结合，抑制肿瘤细胞生长和诱导凋亡；破坏实体瘤周围的血管上皮组织，阻断肿瘤的营养供应，最终导致肿瘤出血性坏死；还可通过引起肿瘤局部的炎症反应和机体的免疫系统发挥抗肿瘤作用。本研究结果显示，SOM230并未增加HCC移植瘤内TNFα水平；组织病理学切片上坏死和肿瘤细胞交界区域也未见炎性细胞浸润，因此，SOM230导致肝癌移植瘤坏死并非通过TNFα的作用。

SOM230具有稳定的环己肽结构，作用时间更持久。本研究在体内实验中仍采用与既往奥曲肽相同的SOM230剂量，动物未出现明显与药物相关的不良反应，肝功能检测显示无明显改变，提示SOM230在体内具有安全性[2]。

总之，新的生长抑素类似物SOM230通过SSTR2介导，可下调肿瘤组织VEGF的表达，阻断生长旺盛肿瘤的血供，导致HCC移植瘤明显坏死。

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