【关键词】肝纤维化; 肝星状细胞； 信号传导 The effect of Smad4 knockdown on the activated hepatic stellate cells LI Ping, LU Wei, 【Key words】Liver fibrosis; Hepatic stellate cell; Signal transduction 【First author’s address】Tianjin Infectious Diseases Hospital, Tianjin 300192, China Email: lplxg@yahoo.com.cn 转化生长因子β(TGFβ)信号转导途径在肝脏纤维化中发挥重要作用。Smad4在信号传输途径中处于中枢地位，Smad4与活化的R-Smads结合成寡聚物，将TGFβ的信号传递到核内，调节靶基因的转录并诱导下游基因的表达[1]。我们针对Smad4基因设计RNAi的真核表达载体，特异性干扰Smad4的基因的表达，以确定其能否对活化肝星状细胞（HSC）产生作用。 一、材料与方法 1．细胞株和质粒：含Hl启动子的转录载体pSilencer3.1-H1hygro质粒购自美国Ambion公司，HSC-T6细胞株由美国纽约西奈山医学院Friedman教授惠赠。 2．主要试剂：T4 DNA连接酶、T4磷酸激酶、SalⅠ购自中国大连宝生物公司，脂质体转染试剂Metafectene购自德国Biontex公司，Ⅲ型胶原酶联免疫吸附法试剂盒，购自中国Uscnlife公司。 3．Ambion公司的设汁软件: 设计合成针对Smad4基因小发夹RNA（shRNA）的寡核苷酸序列。有效靶序列：5′-AAATGGAGCTCATCCTAGCAA-3′（Smad4 mRNA第629位,GenBank NM_008540)。DNA寡核苷酸单链按照表达shRNA的原则设计，由上海博亚生物技术有限公司合成。其shRNA的上游DNA Olig：5′-GATCCATGGAGCTCA TCCTAGCAATTCAAGACGTTGCTAGGATGAGCTCC ATTTTTTTGTCGACA-3′，下游DNA Olig：5′-AGCTT GTCGACAAAAAAATGGAGCTCATCCTAGCAACGTCT TGAATTGCTAGGATGAGCTCCATG-3′，内含BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ酶切位点。正、负DNA寡核苷酸单链经退火后可形成具有粘性末端的DNA双链，磷酸化处理后，并可进一步与经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后的Psilencer3.1-H1-hygro载体连接，转化DH5α大肠杆菌，挑取重组阳性克隆行酶切鉴定及测序鉴定。构建成转录siRNA的质粒以及实验空白对照质粒。 4．质粒转染：待细胞生长融合达60%～80%后，利用脂质体Metafectene转染表达siRNA pSilencer3.1-H1hygro质粒，混合比例为1∶4（质量∶体积），转染步骤按说明书进行。转染后6h，换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，48h后抽提总RNA和总蛋白进行检测。 5．RT-PCR检测Smad4基因表达：Smad4-siRNA转染48h后，24孔板每孔加人500μl Trizol试剂，静置5 min。枪头吹打后吸入离心管中，加人100μl氯仿，离心后取上清液加人异丙醇沉淀，抽提总RNA。Smad4引物使用Primer Premier5.0设计。序列为：正义链5′-AGTAACGATGCC TGTCTGA-3′，反义链 5′-TGAAGTCGTCCATCCAAT-3′，反应条件为： 6．Western blot检测Smad4蛋白表达：Smad4-小干扰RNA（siRNA）24孔板经48h转染后，提取细胞蛋白，按照Biod-ford法测定蛋白浓度。跑十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转膜1h，5%的脱脂奶粉封闭2h，以5%的脱脂奶粉稀释第一抗体Smad4抗体购自美国Santa Cruz公司（1∶200），室温孵育2h， 7．细胞培养上清液中Ⅲ型胶原含量的测定：Smad4-siRNA转染HSC-T6细胞48h后，按照说明书收取细胞上清液，利用酶联免疫吸附法测定Ⅲ型胶原含量。 8．统计学方法：mRNA表达和蛋白表达采用Gel Scan软件进行灰度扫描，半定量分析。所有数值以均数±标准差表示（x-±s），两组计量资料的比较采用t检验，实验组各组间是否存在显著性差异分析采用One-way ANOVA分析。 二、结果 1．阳性克隆的酶切鉴定：经酶切鉴定：质粒Psilence3.1-H1-hygro序列里面2727的位置是有一个SalⅠ的酶切位点的，而在我们的插入序列里面设计了SalⅠ的酶切位点，如果插入正确，就应该能够被SalⅠ酶切出两条DNA条带，一条2170bp，另一条2382bp；而质粒Smad4-siRNA能被SalⅠ酶切出两条DNA条带，即均为插入正确的质粒，见图1。 2．测序鉴定：挑取已转化的质粒菌种测序。经测序，结果完全符合设计要求。 3．RNAi对Smad4 mRNA和蛋白表达的抑制作用：转染表达RNAi干预HSC-T6细胞48h后，Smad4 mRNA和蛋白随干预剂量的增加表达下降。尤其是2μg Smad4-siRNA明显，见图2。灰度扫描半定量结果，随着siRNA 剂量增加，条带亮度变暗，见表1。 4．细胞上清液中Ⅲ型胶原含量测定：转染表达RNAi干预HSC-T6细胞48h后，按照说明书步骤，测定上清液中Ⅲ型胶原含量随干预剂量的增加表达下降，尤其是2μg Smad4-siRNA明显，见表1。 三、讨论 以载体形式，在体内表达shRNA，是一种产生RNA干扰的良好方式，它与化学合成的双链RNA作用一致，且持续时间长、费用低，故适于推广应用[2]。siRNA除了可在哺乳动物细胞水平上阻断基因的表达外，在动物水平上亦可特异而高效地抑制外源基因和内源基因（转基因鼠）的表达[3-4]。本实验选择Smad4基因，根据Elbashir等[5]siRNA设计原则和Ambion网站提供的设计原则及设计软件设计siRNA进行干扰研究。 活化的HSC在肝纤维化过程中起关键作用，是肝纤维化的细胞学基础。活化的HSC-T6细胞是由SV40的T抗原转染大鼠原代肝星状细胞，分泌基质胶原。为了增加siRNA的稳定性，我们设计了转录发夹状siRNA的DNA质粒，并且在5′端进行了磷酸化，因5′端磷酸化的siRNA其活性明显高于非磷酸化的siRNA。测序和酶切结果表明，含有发夹状的siRNA的质粒序列与我们设计的相符。结果表明，我们设计的siRNA对Smad4产生了很好的抑制效果，不仅能够抑制Smad4 mRNA的表达，并且可以在蛋白水平上产生有效的抑制。空白对照无论在RNA水平还是在蛋白水平上都没产生抑制作用，表明siRNA作用是序列特异性的。 有研究显示Smad7具有抑制肝纤维化进展的作用，Smad3也参于肝纤维化进展[6-7]。在Smad4受到阻断后，是否有其他的Smad蛋白，或者有其他的信号传导通路如骨形态发生蛋白（BMP-7）在起作用，尚需要深入研究。本研究结果显示，细胞培养上清液中的Ⅲ型胶原的含量在Smad4抑制组有明显下降。TGFβ1是组织纤维化病变中最重要的促发因子之一，TGFβ1相继与TGFβⅡ型受体、TGFβⅠ型受体结合，再与Smad2、Smad3结合，最后必须与Smad4结合形成异多聚体，才能进入核中调节转录活动。Smad4信号通路在调控TGFβ1介导的细胞外基质沉积过程中处于十分重要的地位，能介导TGFβ1信号传导，调节肝纤维化[8]。本实验表明阻断Smad4表达，使TGFβ1信号通路传导障碍，造成了HSC胶原分泌的减少。调整Smad4分子的表达水平有望成为临床防治肝纤维化的一个有效途径。 参 考 文 献 [1]Shi Y, Massagu J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell, 2003, 113, 685-700. [2]Yu JY, DeRuiter SL, Turner DL. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99: 6047-6052. [3]Sandy P, [4]Lewis DL, Hagstrom JE, Loomis AG, et al. Efficient delivery of siRNA for inhibition of gene expression in postnatal mice. Nat Genet, 2002, 32: 107-108. [5]Elbashir SM, Martinez J, Patkaniowska A, et al. Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. EMB0 J, 2001, 20: 6877-6888. [6]Moro T, Shimoyama Y, Kushida M, et al. Glycyrrhizin and its metabolite inhibit Smad3-mediated type I collagen gene transcription and suppress experimental murine liver fibrosis. Life Sci, 2008, 83: 531-539. [7]Hamzavi J, Ehnert S, Godoy P, et al. Disruption of the Smad7 gene enhances CCl4-dependent liver damage and fibrogenesis in mice. J Cell Mol Med, 2008, 12: 2130-2144. [8]Derynck R, Zhang YE. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature, 2003, 425: 577-584.
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