肝星状细胞诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化的体外研究

【摘要】目的  研究肝星状细胞(HSC)在体外培养的卵圆细胞向成熟肝细胞分化过程中所起的作用。 方法  （1）将卵圆细胞分别与原代培养的HSC混合共培养（混合共培养组），采用Millicell小室不接触共培养（不接触共培养组），卵圆细胞单独培养作为对照组。在共培养后第7、14、21天观测，采用Western blot和荧光定量PCR检测肝细胞核因子4α（HNF-4α）、白蛋白和甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白19（CK-19）的表达量；（2）电子透射显微镜观察卵圆细胞超微结构的变化；（3）过碘酸希夫染色检测各时间点卵圆细胞内糖原颗粒的含量；（4）酶联免疫吸附法检测各时间点卵圆细胞分泌白蛋白的含量。统计学处理采用重复测量资料的多因素方差分析和LSD-t检验。 结果  （1）卵圆细胞第7、14、21天表达HNF-4α和白蛋白的mRNA的量（相对与共培养之前的表达量的倍数）：混合共培养组HNF-4α分别为（1.9±0.2）倍、（10.7±1.2）倍、（12.0±1.3）倍；白蛋白mRNA的量分别为（5.7±1.6）倍、（110.7±13.7）倍、（173.6±22.3）倍；不接触共培养组HNF-4α分别为（1.4±0.1）倍、（3.2±0.6）倍、（8.9±1.4）倍；白蛋白mRNA的量分别为（2.9±1.4）倍、（22.3±8.5）倍、（96.3±16.3）倍。共培养组（混合共培养与不接触共培养组）的表达量均高于对照组，LSD-t值分别为32.98，10.08；13.38，7.96；P值均<0.01，差异有统计学意义。第7、14、21天AFP、CK-19的表达量：混合共培养组AFP分别为（1.1±0.2）倍、（0.2±0.0）倍、（0.0±0.0）倍；CK-19分别为（0.2±0.1）倍、（0.0±0.0）倍、（0.0±0.0）倍；不接触共培养组AFP分别为（1.0±0.2）倍、（0.2±0.1）倍、（0.1±0.0）倍；CK-19分别为（0.6±0.1）倍、（0.1±0.0）倍、（0.0±0.0）倍。共培养组（混合共培养与不接触共培养组）的表达量均低于对照组。LSD-t值分别为37.99，34.50；13.59，22.46；P值均< 0.01，差异有统计学意义。（2）卵圆细胞共培养后白蛋白分泌量明显增加：混合共培养组：14d为（15.30±0.09）ng/ml、21d（20.98±0.12）ng/ml；不接触共培养组14d为（11.41±0.13）ng/ml，21d为（15.12±0.17）ng/ml，混合共培养组高于不接触共培养组，LSD-t＝251.94，P<0.01，差异有统计学意义。（3）随着共培养时间的延长，卵圆细胞内质网、线粒体和高尔基体等细胞器逐渐丰富，且细胞间形成毛细胆管结构。（4）过碘酸希夫染色显示共培养后卵圆细胞内出现大量红色糖原颗粒。 结论  HSC可以诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化，HSC除了通过细胞因子等可溶性因子途径发挥作用外，与卵圆细胞的直接接触也有着重要作用。

【关键词】肝细胞;  白蛋白类； 甲胎蛋白类;  肝星状细胞； 卵圆细胞

Differentiation of hepatic oval cell into mature hepatocyte induced by hepatic stellate cells    CHEN Lin, CHEN Xiao-ping, ZHANG Wei, LIANG Hui-fang, LIN You-zhi, DONG Han-hua, ZHOU Qiao-dan. Department of Hepatic Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

Corresponding author: CHEN Xiao-ping, Email: northwood001@126.com

【Abstract】 Objective    To investigate the role of hepatic stellate cells in the differentiation of hepatic oval cells into adult hepatocyte. Methods    The oval cell were cocultured with primary hepatic stellate cells (HSC) in the same well (M-coculture) or separately cultured with HSC by millIcell (S-coculture). Oval cells were cultured alone as control; the expression of adult hepatocyte marker HNF-4α, albumin, and oval cell marker AFP, CK-19 in each group were detected by real-time PCR and western-blot.  Phenotype changes were observed by transmission electron microscope (TEM); PAS staining was used to detect the quantity of glycogen granule in oval cell. Albumin level in supernatant was detected using ELISA kit. Result    (1) The relative level of HNF-4α and albumin mRNA expression compared with pre-coculture: M-coculture:HNF-4α: 1.9±0.2, 10.7±1.2, 12.0±1.3; albumin: 5.7±1.6, 110.7±13.7, 173.6±22.3. S-coculture: 1.4±0.1, 3.2±0.6, 8.9±1.4 times; albumin: 2.9±1.4, 22.3±8.5, 96.3±16.3. The relative level of HNF-4α and albumin mRNA expression in coculture group (M- and S-colculture) were higher than control group (LSD-t: 32.98, 10.08, 13.38, 7.96; P < 0.01); and a higher level of HNF-4a and albumin was found in M-coculture group compared to S-coculture group (LSD-t: 32.98, 25.65; P < 0.01). The relative level of AFP and CK-19 mRNA expression compared with pre-coculture: M-coculture: 1.1±0.2, 0.2±0.0, 0.0±0.0; S-coculture group: AFP: 1.0±0.2, 0.2±0.1, 0.1±0.0; CK-19: 0.6±0.1, 0.1±0.0, 0.0±0.0; control group: AFP: 1.0±0.1, 1.0±0.1, 1.1±0.1, CK-19: 1.0±0.1, 1.1±0.1, 1.0±0.1. The relative level of AFP and CK-19 mRNA expression in coculture group(M- and S-colculture) were lower than that in control group (LSD-t: 37.99, 34.50, 13.59, 22.46; P < 0.01). (2) The albumin secretion was detected in M-coculture: 14day: (15.30±0.09) ng/ml, 21: (20.98±0.12) ng/ml; S-coculture: 14 day: (11.41±0.13) ng/ml, 21day:(15.12±0.17) ng/ml. (3) It showed more organelles such as endoplasmic reticulum, mitochondrion and Golgi apparatus in oval cells cocultured with HSC. And cholangiole-like structure appeared between oval cells cocultured with HSC. (4) PAS staining showed glycogen granules could be observed in coculture groups. Conclusion    HSC can induce differentiation of oval cell into mature hepatocyte.

【Key words】Hepatocytes;  Albumins;  Alpha-Fetoproteins;  Hepatic stellate cells,    Hepatic oval cells

在理化因素及感染等造成肝损伤的情况下，成熟肝细胞增殖受抑制或不能满足肝功能的代偿要求时，卵圆细胞活化，增殖，分化成成熟肝细胞，参与肝再生[1]。在卵圆细胞增殖分化成为成熟肝细胞的过程中，其所处的肝脏微环境起到极为重要的调控作用[2]。肝星状细胞（HSC）是多种细胞外基质和细胞因子的重要来源，推测其在卵圆细胞向肝细胞分化的过程中起到重要的作用[3]。本实验探讨HSC对卵圆细胞向肝细胞定向分化的调控作用及机制。

材料与方法

1. 实验动物：雄性SD大鼠（华中科技大学同济医学院动物实验中心提供）体质量300g左右，常规饲料喂养，正常饮水。

2. HSC的分离、培养和鉴定：参照文献[4]的方法略有修改。大鼠麻醉消毒后，下腔静脉门静脉插管，推注含肝素的预热的磷酸盐缓冲液（PBS）20ml/min，待下腔静脉流出液变清，取下肝脏离体灌注0.05%Ⅳ型胶原酶（购自美国Sigma公司）20ml/min，15min。剪碎肝脏，置于0.05%Ⅳ型胶原酶中37℃振荡消化15min，200目筛网滤过。细胞悬液50×g离心10min，2次，取上清液，400×g离心10min，0.08%蛋白酶E（购自美国Sigma公司）振荡消化15min；DMEM（购自美国Gibco公司）重悬细胞，将细胞悬液小心铺于已预制连续密度梯度（28000×g离心15min）的25% Percoll（购自美国Sigma公司）上，800×g离心15min，小心吸取上层细胞混浊带，PBS液400×g离心10min洗涤1遍，用含10%胎牛血清（购自美国Hyclone公司）的DMEM重悬细胞，显微镜下锥虫蓝染色测定细胞活力，并计数。按2×105个细胞/ cm2接种于1次性25cm2玻璃培养瓶。30min后将细胞悬液吸出，种于另一培养瓶。24h后换液，以后每3d换液1次。待细胞融合达到80%～90%时进行传代，传代时按常规使用0.25%胰酶。细胞贴壁1周后用相差显微镜（Nikon Digital ECLIPSE C1型，购自日本Nikon公司），观察HSC形态，并采用免疫荧光鉴定HSC结蛋白（购自美国NewMark公司）效价1∶100的表达情况。

3. 卵圆细胞LE6细胞系的培养：LE6细胞由美国Nelson Fausto教授馈赠。细胞用含10%胎牛血清的DMEM在37℃，5% CO2条件下培养，每2～3d换液，待细胞长满单层后用0.25%胰酶消化传代。

4. 试验分组：分为不接触共培养组，混合共培养组和对照组。分离共培养组时将HSC以1×104个/孔接种于6孔板底部，将卵圆细胞按1×104个/孔接种于Millicell小室（购自美国Millipore公司）中；混合共培养组，将HSC以1×103个/孔，卵圆细胞以1×104个/孔混合同时接种于6孔板中；卵圆细胞按1×104个/孔接种至6孔板作为对照。每2～3d换液1次。做电镜检查和细胞免疫荧光检测时将卵圆细胞传于预置有玻片的6孔板中。

5. 总RNA的提取和逆转录：分别在共培养7、14、28d将细胞小心消化离心后加入1ml Trizol Reagent（购自美国Invetrogen公司），提取总RNA，采用立陶宛Fermentas公司的RT-PCR试剂盒逆转录合成cDNA，严格按试剂盒说明书进行操作。取0.1g肝组织放入匀浆器中，加入1ml Trizol Reagent在冰上匀浆30min，抽取上清液提取总RNA并逆转录为cDNA。

6. 荧光定量PCR检测：肝细胞核因子4α（hepa-tocyte neclear factor-4α, HNF-4α）和白蛋白，细胞角蛋白-19（cytokeratin-19，CK-19），甲胎蛋白（AFP）以及内参照β-肌动蛋白（β-actin）的基因引物序列利用Primer5.0软件设计，解链温度均为60℃，荧光定量PCR引物序列见表1。荧光定量PCR试剂盒购自美国ABI公司，25μl体系用ABI Prism7000荧光定量PCR仪（购自美国ABI公司）检测。利用比较Ct值法检测共培养前后卵圆细胞表达HNF-4α和白蛋白，CK-19, AFP的表达情况。重复3次。

7. Western blot：分别在共培养前，共培养第7、14、21d收集各组卵圆细胞，取总蛋白, 蛋白定量试剂盒（购自美国Pierce公司）测定各样本蛋白浓度，加样量为100μg，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转蛋白到聚偏二氟乙烯膜（购自美国Millipore公司）上,转膜条件：β-actin：200mA，60min；HNF-4α: 200mA，70min；白蛋白：200mA，80min，CK-19：200mA，60min；AFP：200mA，80min。用5%脱脂奶粉封闭1h后加第一抗体4℃孵育过夜。鸡抗大鼠白蛋白抗体购自英国Abcam公司，效价1∶500；山羊抗大鼠HNF-4α，小鼠抗大鼠AFP购自美国Santa Cruz公司，效价均为1∶500；小鼠抗大鼠细胞角蛋白19购自美国Millipore公司，效价1∶300。洗膜后加第二抗体孵育2h（羊抗鸡IgG购自北京博奥森公司，效价1∶300，兔抗山羊IgG, 羊抗小鼠IgG购均自美国Pierce公司，效价1∶5000），增强化学发光试剂盒（购自美国Pierce公司）发光。独立试验重复3次。

8. 过碘酸希夫染色：共培养后21d，各组细胞爬片先经75%乙醇固定10min，1%过碘酸水溶液处理10min，蒸馏水洗3次，希夫试剂孵育10min，流水冲洗10min，光镜下观察。

9. 电镜形态学检查：共培养21d后，将卵圆细胞经70%戊二醛固定后常规包埋切片，采用透射电子显微镜（Tecnai G2 12型，购自荷兰FEI公司）观察卵圆细胞的超微结构。

10. 酶联免疫吸附法检测白蛋白的分泌量：分别在共培养前，共培养第7、14、21天收集各组卵圆细胞，按5×105个/孔接种入6孔板，待细胞贴壁以后，将培养液换为3ml无血清培养液，24h后收集培养液上清液，采用酶联免疫吸附法试剂盒（购自美国immunology consultants laboratory公司）检测细胞上清液中的白蛋白含量，独立试验重复3次。

11. 统计学方法：各试验独立重复3次，每次3个样本。各统计结果采用均数±标准差（x-±s）表示，利用SPSS软件进行统计，采用重复测量资料的多因素方差分析和LSD-t检验分析组间差别，P<0.05为差异有统计学意义。

结    果

1. HSC的鉴定：每只大鼠可获得HSC（1.7±0.4）×107个，锥虫蓝拒染实验证实细胞存活率为92.6%±2.3%，接种入培养瓶后24h内全部贴壁，呈梭形，培养1周后细胞逐渐伸展呈星状多边形，免疫荧光显示细胞胞质强表达结蛋白。细胞纯度94.2%±3.1%，见图1。

2. 卵圆细胞mRNA的表达变化：（1）混合共培养组和不接触共培养组成熟HNF-4α表达量明显高于对照组，LSD-t值分别为32.98和10.08，P值均<0.01，差异有统计学意义。混合共培养组HNF-4α的表达量明显高于不接触共培养组，LSD-t＝32.98，P<0.01，差异有统计学意义。（2）混合共培养组和不接触共培养组白蛋白的表达量明显高于对照组，LSD-t值分别为13.38和7.96, P<0.01或<0.05，差异有统计学意义。混合共培养组白蛋白mRNA表达量高于不接触共培养组，LSD-t＝25.65，P<0.01，差异有统计学意义。（3）混合共培养组和不接触共培养组AFP的表量低于对照组，LSD-t值分别为37.99和34.50，P值均<0.01，差异有统计学意义。混合共培养组AFP的表达量则低于不接触共培养组，LSD-t＝11.99，P<0.01，差异有统计学意义。（4）混合共培养组和不接触共培养组CK-19的表达明显低于对照组，LSD-t值分别为13.59和22.46，P值均<0.01，差异有统计学意义。混合共培养组CK-19表达量低于不接触共培养组，LSD-t＝8.44，P<0.05，差异有统计学意义，见表2。

3. 细胞标志物蛋白的表达变化：（1）混合共培养和不接触共培养组成熟HNF-4α的表达量高于对照组，LSD-t分别为29.32和14.75，P值均<0.01，差异有统计学意义。同时，混合共培养组HNF-4α的表达量要高于不接触共培养组，LSD-t＝9.17，P<0.05，差异有统计学意义。（2）混合共培养和不接触共培养组白蛋白的表达量高于对照组LSD-t 分别为25.74和42.42，P值均<0.01，差异有统计学意义；同时，混合共培养组白蛋白的表达量要高于不接触共培养组LSD-t＝13.52, P<0.01，差异有统计学意义。（3）混合共培养和不接触共培养组AFP的表达量均低于对照组，LSD-t分别为29.38和29.21，P值均<0.01，差异有统计学意义。而混合共培养组AFP的表达量要低于不接触共培养组，LSD-t＝32.65，P值均<0.01，差异有统计学意义。（4）混合共培养和不接触共培养CK-19的表达量低于对照组。LSD-t分别为21.41和19.31，P值均< 0.01，差异有统计学意义。而混合共培养组CK-19的表达量要低于不接触共培养组LSD-t＝30.33，P值均<0.05，差异有统计学意义，见图2，表3。

4. 过碘酸希夫染色糖原染色观察结果：共培养21d后卵圆细胞胞浆中可见大量粗大红色糖原颗粒，而对照组过碘酸希夫染色呈阴性，混合共培养组和不接触共培养组之间，差异无统计学意义，见图3。

5. 电子显微镜观察结果：对照组卵圆细胞体积较小，直径在7～10μm左右,胞核大,胞质相对较少,核质比高,胞浆内细胞器较少，仅见少量内质网（图4A）；混合和不接触共培养1周后均可发现：卵圆细胞内细胞器明显增多，可见大量扩张内质网和丰富的线粒体（图4B）; 混合和不接触共培养3周以后卵圆细胞胞浆内除内质网、线粒体外，还可见到丰富的高尔基体，提示卵圆细胞有分泌蛋白质的功能（图4C）出现细胞间连接复合体，并形成胆小管样结构和微绒毛（图4D）。

6. 卵圆细胞分泌白蛋白的浓度：共培养之前及对照组的细胞培养液上清液均未检测到白蛋白，共培养组在共培养14d后，细胞培养液上清液中出现白蛋白，混合共培养组（15.30±0.09）ng/ml，不接触共培养组（11.41±0.13）ng/ml；共培养21d后，细胞培养液上清液中白蛋白含量有所增加，混合共培养组（20.98±0.12）ng/ml，不接触共培养组（15.12±0.17）ng/ml。结果显示共培养后卵圆细胞获得了分泌白蛋白的功能。而且，混合共培养组的白蛋白分泌量要高于不接触共培养组（LSD-t＝251.94，P＝8.76e-006）。

讨    论

卵圆细胞有向成熟肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的能力，其分化的方向取决于周围微环境的影响。在2-AAF/PH卵圆细胞增殖模型中，HSC与卵圆细胞在空间位置、增殖时间等方面有密切关系[5]。说明HSC可能对卵圆细胞的增殖分化产生影响。

本研究结果显示，与HSC共培养之后，HNF-4α和白蛋白明显增加，而AFP和CK-19则逐渐低表达。与之相应的是随着共培养时间的延长，卵圆细胞的形态也逐渐向成熟肝细胞变化，表现为核质比变小，细胞器丰富，细胞之间形成毛细胆管样结，缝隙连接和桥粒连接正是上皮细胞的特征。是细胞间出现毛细胆管样结构则是卵圆细胞向成熟肝细胞分化的一个直接证据[6]。共培养后的卵圆细胞也表现出成熟肝细胞特有的功能，如糖原合成和分泌白蛋白[7]。HSC可以诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化。

由于不接触共培养组采用的Millicell小室的半透膜只允许可溶性分子通过，而细胞不能透过，提示HSC是通过其分泌的可溶性细胞因子影响卵圆细胞的分化。HSC可分泌多种细胞因子如肝细胞生长因子、酸性成纤维生长因子、表皮细胞因子及转化生长因子β，而卵圆细胞则表达上述细胞因子的受体[3]。肝细胞生长因子是一种重要的促进肝脏干细胞增殖的细胞因子，通过与细胞表面受体c-Met结合进而激活下游信号通路，并可促进卵圆细胞的增殖, 并且有体外实验证实肝细胞生长因子可以定向诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化，酸性成纤维生长因子、表皮细胞因子等细胞因子联合使用可以定向诱导卵圆细胞向成熟肝细胞方向分化[8-9]。转化生长因子β具有诱导肝脏卵圆细胞凋亡，促进其分化的能力[10]。因此很有可能是HSC通过上述可溶性细胞因子，定向诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化，而抑制其向胆管上皮细胞分化。同时我们发现混合共培养组HNF-4α、白蛋白的表达量和白蛋白的分泌量均明显高于不接触共培养组，提示除了可溶性的细胞因子，HSC可能通过细胞间的直接相互接触作用或通过其自身分泌的细胞外基质介导的相互作用，诱导卵圆细胞的分化，已有研究表明，将卵圆细胞接种于细胞外基质（Ⅰ型胶原等）包被的培养皿中，可促进卵圆细胞向成熟肝细胞分化[9]。也有体内实验证实细胞外基质层黏连蛋白和纤维连接蛋白与卵圆细胞的增殖和分化有密切的联系[5]。 

因此，肝脏干细胞可通过可溶性细胞因子及其分泌的细胞外基质定向诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化，而不向胆管细胞分化。尽管如此，在卵圆细胞分化过程中起决定作用的是可溶性的细胞因子而不是细胞间相互作用。由于HSC分泌细胞因子多种多样，HSC与卵圆细胞直接相互作用叠加效果极为复杂，因此，HSC具体通过上述何种途径或者是否有协同作用需要进一步实验加以证实。

参  考  文  献

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