乙型肝炎病毒转基因小鼠B7H1表达水平与免疫耐受的相关性

【摘要】目的  探讨HBV转基因（Tg）小鼠脾脏树突状细胞（DC）及肝脏B7-H1表达水平与HBV免疫耐受的相关性。 方法  制备小鼠脾脏DC，混合淋巴细胞反应检测其同种抗原刺激能力，流式细胞仪检测DC表面主要组织相容性复合物-Ⅱ（MHC-Ⅱ）及CD80、CD86、B7-H1等共刺激分子表达水平，酶联免疫吸附法检测白细胞介素-2（IL-2）、干扰素γ、IL-10水平，逆转录聚合酶链反应法和Western blot法检测肝组织B7-H1表达水平。计量数据组间比较采用t检验。 结果  DC和T淋巴细胞比例分别为1∶1、1∶10、1∶100时,HBV Tg小鼠脾脏DC刺激同种小鼠T淋巴细胞增殖数量（每分钟放射细胞数）分别为（865.4±39.3）个、（680.2±34.8）个和（320.0±12.7）个，正常小鼠刺激同种小鼠T淋巴细胞增殖数量分别为（22385.6±99.7）个、（17850.6±79.4）个和（760.0±32.1）个，HBV Tg小鼠脾脏DC刺激同种小鼠T淋巴细胞增殖能力明显均弱于正常小鼠DC，t值分别为16.674、19.674和21.712，P值均<0.01，差异有统计学意义。同时,HBV Tg小鼠MHC-Ⅱ、CD80表达下调,而CD86、B7-H1表达差异无统计学意义。HBV Tg小鼠分泌IL-2、干扰素γ、IL-10水平均降低，而HBV Tg小鼠和正常小鼠肝组织表达B7-H1的差异无统计学意义。 结论  HBV免疫耐受与MHC-Ⅱ、CD80下调表达导致的HBV Tg小鼠脾脏DC功能缺陷有关，而与负性共刺激分子B7-H1表达无关。                 

【关键词】肝炎病毒,乙型； 树突状细胞； B7-H1； 免疫耐受

The study on the relationship between expression of B7-H1 on HBV transgenic mice and immune tolerance to HBV   WANG Zhuo-yi, HE Jiang-juan, GENG Lei, ZHOU Lin, XIE Hai-yang, WU Jian, ZHENG Shu-sen. Division of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, Department of Surgery, First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Key Laboratory of Combined Multi-organ Transplantation, Ministry of Public Health, Key Laboratory of Organ Transplantation, Zhejiang Province, Hangzhou 310003,China

Corresponding author: ZHENG Shu-sen, Email: shusenzheng@zju.edu.cn

【Abstract】 Objective    To investigate whether there is an association between the expression of B7-H1 in HBV transgenic mice and the immune tolerance to HBV. Methods    T cells stimulatory capacity of DC was analyzed using mixed lymphocyte reaction. Expression of MHC-II, CD80, CD86, B7-H1 on DC was detected by Flow Cytometry. IL-2, IFNγ, IL-10 production of T cells were determined by using ELISA. B7-H1 mRNA and protein expression in liver tissue were detected by RT-PCR and Western blotting respectively. Results    The ability of DC cells from HBV transgenic mice to stimulate T cell proliferation was significantly impaired compared with DC cells from control mice (t = 16.674, 19.674, 21.712, P < 0.01). Expression of MHC-II, CD80 on DC was markedly decreased in transgenic mice (t = 7.910, 6.413, P < 0.05). Meanwhile, the expression of CD86 and B7-H1 on DC cells in HBV transgenic mice were not significantly different from that  in control mice. The levels of IL-2, IFNγ, IL-10 in supernantant of T cells was significantly lower compared with controls (t = 18.712, 18.712 and 11.683, P < 0.05). There was no significant difference in B7-H1 expression at mRNA and protein levels in liver tissue compared with controls. Conclusions    Functional defeact of DC, partly due to decreased expression of MHC-II, CD80, but not related to B7-H1 expression, is the cause for immune tolerance to HBV in HBV transgenic mice.

【Key words】Hepatitis B virus;  Dendritic cells;  B7-H1;  Immune tolerance

慢性HBV感染时机体细胞免疫应答的削弱与树突状细胞（DC）功能的缺陷有密切关系[1-2]。DC功能状况与其表面正性共刺激分子及负性共刺激分子表达水平密切相关[3]。慢性乙型肝炎时DC功能的缺陷与主要组织相容性复合物-Ⅱ（MHC-Ⅱ）及表面共刺激分子如CD80、CD86表达下调有关[4]，但是否也存在负性共刺激分子如B7-H1的表达异常尚不清楚。慢性HBV感染时有库普弗细胞和肝窦内皮细胞功能的异常，而B7-H1可表达于库普弗细胞和肝窦内皮细胞表面，并负性调节其功能，故推测B7-H1可能是慢性HBV感染时库普弗细胞和肝窦内皮细胞功能异常的原因之一[5-6]。因此，我们进行了相关实验研究。

材料与方法

一、材料

HBV转基因（transgenic，Tg）小鼠C57BL/6J TgN（A1b1HBV）44Bri HBV购于北京大学医学部。该鼠是1998年2月从美国Jackson实验室引进的，其转入的基因源于HBV的ayw亚型，所转移的基因片段是编码HBsAg的S基因、preS基因、X基因。同时于浙江省实验动物中心购买同系正常C57BL/6J小鼠，6～8周龄，清洁级环境中饲养。于浙江省实验动物中心购买BALB/c小鼠用于混合淋巴细胞反应。

二、方法

1. 脾脏DC的制备：将小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡2min后开腹取脾，置于200目不锈钢网上，剪刀剪碎后用注射器针芯轻轻捻抹脾脏组织，磷酸盐缓冲液（PBS）制备脾细胞悬液。红细胞裂解液破解红细胞后，用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基重悬细胞，RPMI 1640购自美国Chemicon公司。脾细胞悬液移入培养瓶中，37℃，5% CO2孵育3h后弃去悬浮细胞（T淋巴细胞和B淋巴细胞）。继续培养细胞18h，轻轻吹打细胞，收集悬浮细胞。

2. 单向混合淋巴细胞反应：BALB/c小鼠脾脏T淋巴细胞作为反应细胞。尼龙膜过滤巨噬细胞和B淋巴细胞（可黏附于尼龙毛表面），因此可以分离T淋巴细胞；上述方法制备脾脏DC作为刺激细胞，RPMI 1640调整DC浓度为1×106/ml，加入丝裂霉素C（25μg/ml），37℃，5% CO2孵育30min。RPMI 1640洗涤3次以去除残留丝裂霉素C。96孔平底细胞培养板，调整刺激细胞分为：1×106个/ml、1×105个/ml、1×104个/ml，每孔100μl，设3个复孔。接种细胞后，水平转动96孔培养板，使细胞均匀混合。每孔加入反应细胞和刺激细胞各100μl，对照组包括单独反应细胞100μl和单独刺激细胞100μl以及空白对照。37℃，5% CO2孵育6d，结束反应前18h掺入3H胸腺嘧啶。最后多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，烤箱内烘干。然后将载有细胞的滤纸放入盛有2ml闪烁液的计数瓶中,β液闪测定仪计算每分钟放射细胞数。

3. 酶联免疫吸附法（ELISA）检测淋巴细胞分泌白细胞介素（IL）-2、干扰素γ（IFNγ）、IL-10水平：IL-2、IFNγ、IL-10单克隆抗体试剂盒购自美国BD公司，根据说明书步骤进行操作。配制包被缓冲液，用包被缓冲液1∶250稀释包被抗体；每孔100μl加入酶标板，4℃孵育过夜，洗板3次（洗涤液：含0.05%吐温-20的PBS）；封闭：每孔加入200μl分析液，室温孵育1h；洗板3次；加样：每孔加入100μl的标准品、样品或质量控制样品，室温孵育2h；洗板5次；交联：每孔加入100μl的检测工作液（生物素标记的抗IL-2单克隆抗体+亲合素-辣根过氧化物酶连接物），室温孵育1h；洗板7次；显色：每孔加入100μl的显色底物，避光、室温孵育30min后，每孔加入50μl的终止液；于30min内读取吸光度值A450nm绘制标准曲线，求得样品浓度。

4. 流式细胞仪检测DC表面共刺激分子表达：100μl DC细胞悬液分别加入单克隆抗体：PEcy5-CD11c (同型对照：美国仓鼠IgG)、FITC-MHC-Ⅱ (同型对照：小鼠IgG2a)、PE-CD80 (同型对照：小鼠IgG2a)、FITC-CD86 (同型对照：大鼠IgG2a)、PE-B7-H1 (同型对照：大鼠IgG2a)。上述抗体均购自美国eBioscience公司。室温孵育20min，PBS洗涤1次后再用200μl PBS重悬，上机检测。

5. 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测小鼠肝脏B7-H1 mRNA表达水平：根据试剂盒说明提取小鼠肝脏RNA，引物由上海生工生物技术公司合成，小鼠B7-H1上游引物为5′-CTGCTTGCG TTAGTGGTGTA-3′，下游引物为5′-CCTCGGCC TGACATATTAGT-3′。小鼠β-肌动蛋白上游引物为5′-AAAGATTCGTGAATGAC-3′，下游引物为5′-TACAAGCACTTGCTTGTG-3′。

6. Western blot法检测小鼠肝脏B7-H1蛋白表达水平：小鼠B7-H1 Western blot抗体购自美国RD公司。提取小鼠肝脏蛋白，l0%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至聚偏氟乙烯膜上，含5%脱脂奶粉的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）封闭2h，把膜放入1∶1000稀释的第一抗体中，温和振荡1h（4℃）后置4℃冰箱中过夜。再温和振荡（4℃）2h，回收第一抗体后在含吐温-20的TBS缓冲液中洗膜20min，中间更换TBS液2～3次，分别把膜置于1∶2000稀释的第二抗体（辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG）中温和振荡1.5h，在TBS中洗膜15min，曝光、显影及定影，通过凝胶成像系统读取目的条带的密度扫描值。

7. 统计学分析：采用SPSS10.0软件包，计量数据用均数±标准差（x-±s），组间比较采用t检验。

结    果

1. HBV Tg小鼠和正常小鼠脾脏DC刺激同种小鼠T淋巴细胞增殖能力：DC和T淋巴细胞比例分别为1∶1、1∶10、1∶100时，HBV Tg小鼠脾脏DC刺激同种小鼠T淋巴细胞增殖数量(每分钟放射细胞数)分别为（865.4±39.3）个、（680.2±34.8）个和（320.0±12.7）个，正常小鼠刺激同种小鼠T淋巴细胞增殖数分别为（22385.6±99.7）个、（17850.6±79.4）个和（760.0±32.1）个，HBV Tg小鼠脾脏DC刺激同种小鼠T淋巴细胞增殖能力明显均弱于正常小鼠DC，t值分别为16.674、19.674和21.712，P值均<0.01，差异有统计学意义。

2. HBV Tg小鼠和正常小鼠脾脏DC刺激淋巴细胞分泌IL-2、IFNγ、IL-10水平：HBV Tg小鼠脾脏DC刺激T淋巴细胞分泌IL-2、IFNγ、IL-10水平分别为（525.3±24.0）pg/ml、（584.1±28.1）pg/ml和（128.1±10.1）pg/ml，正常对照小鼠分别为（817.2±45.5）pg/ml、（910.5±30.3）pg/ml和（224.8±12.0）pg/ml，HBV Tg小鼠脾脏DC刺激淋巴细胞分泌IL-2、IFNγ、IL-10水平均较正常对照小鼠相应降低，t值分别为18.712、18.712和11.683，P值均<0.05，差异有统计学意义。

3. HBV Tg小鼠和正常小鼠脾脏DC表面MHC-Ⅱ及共刺激分子CD80、CD86、B7-H1表达：HBV Tg小鼠和正常小鼠脾脏DC的MHC-Ⅱ表达分别为25.0±1.3和50.0±2.3，CD80表达分别为20.0±1.2和41.0±2.1, HBV Tg小鼠MHC-Ⅱ和CD80表达下调，t值分别为7.910和6.413，P值均<0.05，差异有统计学意义。CD86表达分别为64.0±3.3和60.0±3.2、B7-H1表达分别为97.0±3.4和95.0±3.8，t值分别为0.912和2.782，P值均>0.05，两组小鼠CD86和B7-H1表达，差异无统计学意义。

4. HBV Tg小鼠和正常小鼠肝脏组织B7-H1表达情况：HBV Tg小鼠和正常小鼠肝脏组织B7-H1 mRNA表达分别为1.147±0.026和1.128±0.031，t＝0.939，P>0.05，差异无统计学意义，见图1。HBV Tg小鼠和正常小鼠肝脏组织B7-H1蛋白表达分别为0.426±0.079和0.408±0.065，t＝0.352，P>0.05，差异无统计学意义，见图2。

讨    论

虽然慢性乙型肝炎的发病机制尚未完全阐明，但细胞免疫缺陷是宿主不能有效完全清除HBV的主要原因。DC作为专职抗原提呈细胞在激发和协调细胞免疫反应上发挥关键作用。慢性HBV感染时机体细胞免疫应答的削弱与DC功能的缺陷有密切关系。慢性乙型肝炎患者DC表面CD80、CD86、CD1a及HLA-Ⅱ类分子表达和DC培养上清液IL-12水平明显低于正常人。经HBsAg疫苗免疫后，患者血清IL-12水平和DC表达CD80、CD86均上调[7]。本研究结果显示HBV Tg小鼠脾脏DC刺激同种T淋巴细胞增殖能力较正常小鼠DC明显减弱，同时T淋巴细胞分泌细胞因子谱也发生了变化，IL-2、IFNγ、IL-10水平降低。DC表型显示MHC-Ⅱ和共刺激分子CD80下调，这可能是DC功能缺陷的原因之一，因为，DC的功能依赖于MHC-Ⅱ和共刺激分子CD80、CD86等的表达水平。由于负性共刺激分子对免疫的负性调节功能，我们也探讨了DC功能缺陷是否也有负性共刺激分子失常表达。B7-H1是新近发现的负性共刺激分子通路，在体外能刺激T淋巴细胞分泌大量IL-10，并能抑制活化T淋巴细胞的增殖[8]；大量研究表明B7-H1通路在负调T淋巴细胞免疫反应和DC功能上发挥重要作用[9-11]。我们检测了HBV Tg小鼠DC表面B7-H1的表达水平，结果显示HBV Tg小鼠DC和正常小鼠DC表达，差异无统计学意义。

肝脏免疫细胞有效的发挥免疫机能对防御和清除入侵HBV有重要作用。肝脏枯否细胞、DC、肝窦内皮细胞等非实质细胞是肝脏发挥免疫功能的细胞基础[12]。作为抗原提呈细胞库普弗细胞和肝窦内皮细胞既可表达B7-1、B7-2、细胞间黏附分子-1以有效活化T淋巴细胞增殖，刺激其分泌细胞因子，也可诱导T淋巴细胞免疫耐受，慢性乙型肝炎时有枯否细胞、肝窦内皮细胞功能的失常，而B7-H1又有负性调节枯否细胞、肝窦内皮细胞功能的作用[13]。我们探讨了HBV Tg小鼠肝脏B7-H1表达水平，结果显示在mRNA和蛋白水平皆无明显差异，因此，我们认为不论是作为专职抗原提呈细胞的DC，还是兼职抗原提呈细胞的库普弗细胞、肝窦内皮细胞，其对HBV的免疫耐受，均不通过改变B7-H1的表达水平来实现。

尽管HBV Tg小鼠能模拟慢性乙型肝炎时HBV的持续复制状态，但和慢性乙型肝炎相比仍存在很多不同之处。（1）患者的慢性感染是HBV病毒自然入侵，继而造成肝脏慢性炎症。（2）人类的HBV感染有几个不同的阶段，包括免疫耐受期、慢性乙型肝炎期和非活动性或无症状HBV携带期、康复期。（3）人类患者宿主和病毒之间的免疫更复杂。因此，有必要进一步探讨HBV慢性感染患者DC功能状况与B7-H1表达以及肝脏B7-H1表达水平。

参  考  文  献

[1]Zheng BJ, Zhou J, Qu D, et al. Selective functional deficit in dendritic cell - T cell interaction is a crucial mechanism in chronic hepatitis B virus infection . J Viral Hepat, 2004,11:217-224.

[2]Chen MQ, Shi GF, Lu Q, et al. Phenotypes and functions of dendritic cells derived from peripheral blood monocytes of chronic hepatitis B patients with different HBV DNA loads. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2007, 15: 19-23.(in Chinese)

陈明泉,施光峰,卢清,等.不同病毒载量的慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的表型和功能.中华肝脏病杂志,2007,15:19-23.

[3]Larsen CP, Ritchie SC, Hendrix R, et al. Regulation of immunostimulatory function and costimulatory molecule (B7-1 and B7-2) expression on murine dendritic cells. J Immunol, 1994, 152:5208-5219.

[4]Akbar SM, Inaba K, Onji M. Upregulation of MHC class II antigen on dendritic cells from hepatitis B virus transgenic mice by interferon-gamma: abrogation of immune response defect to a T-cell-dependent antigen. Immunology, 1996,87:519-527.

[5]Katz SC, Pillarisetty VG, Bleier JI, et al. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. J Immunol, 2004, 173:230-235.

[6]Iwai Y, Terawaki S, Ikegawa M, et al. PD-1 inhibits antiviral immunity at the effector phase in the liver. J Exp Med, 2003, 198: 39-50.

[7]Horiike N, Md Fazle Akbar S, Ninomiya T, et al. Activation and maturation of antigen-presenting dendritic cells during vaccine therapy in patients with chronic hepatitis due to hepatitis B virus. Hepatol Res, 2002, 23: 38-47.

[8]Dong H, Zhu G, Tamada K, et al. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat Med, 1999, 5: 1365-1369.

[9]Nakazawa A, Dotan I, Brimnes J, et al. The expression and function of costimualtory molecules B7H and B7-H1 on colonic epithelial cells. Gastroenterology, 2004, 126: 1347-1357.

[10]Dong H, Strome SE, Salomao DR, et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat Med, 2002, 8: 793-800.

[11]Selenko-Gebauer N, Majdic O, Szekeres A, et al. B7-H1 (Programmed death-1 ligand) on dendritic cells is involved in the induction and maintenance of T cell anergy . J Immunol, 2003, 170: 3637-3644.

[12]Limmer A, Ohl J, Kurts C,et al. Efficient presentation of exogenous antigen by liver endothelial cells to CD8+ T cells results in antigen-specific T-cell tolerance. Nat Med, 2000, 6: 1348-1354.

[13]Geng L, Zheng SS. B7-H1 and liver immunity. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 718-720. (in Chinese)

耿磊,郑树森.B7-H1与肝脏免疫.中华肝脏病杂志,2005,13:718-720.