肝纤维化过程中去甲肾上腺素各受体亚型表达的动态变化

【摘要】  目的  研究肝纤维化过程中去甲肾上腺素各受体亚型表达的动态变化。 方法  胆总管结扎法建立大鼠肝纤维化模型，HE、Masson染色观察肝脏病理形态学变化；免疫组织化学法检测肝星状细胞活化指标α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达情况；Western blot和实时荧光定量PCR检测α-肾上腺素受体（AR）、β1-AR、β2-AR蛋白和mRNA的表达水平。对数据进行单因素方差分析、LSD检验及相关分析。 结果  HE及Masson三色染色显示：随着造模时间延长肝纤维化程度逐渐加重。α-SMA免疫组织化学染色显示：随着肝纤维化的发展，大鼠肝组织中α-SMA阳性细胞明显增多，造模1、2、3、4周时分别为10.58%±1.75%、24.14%±2.02%、29.74%±2.59%、34.28%±2.01%，而假手术组为4.12%±1.51%，P<0.01。Western blot检测结果显示，造模1～4周大鼠肝组织α-AR、β1-AR、β2-AR蛋白表达量均明显升高（P<0.05）。实时荧光定量PCR结果证实，随着肝纤维化的发展，α-AR、β1-AR、β2-AR mRNA表达水平均逐渐上升（P<0.01）。α-SMA与α-AR、β1-AR、β2-AR蛋白表达水平的相关分析显示，α-SMA与α-AR、β1-AR及β2-AR呈正相关，r值分别为0.564，0.753和0.606。 结论  胆总管结扎法成功建立胆汁淤积性大鼠肝纤维化模型，在肝纤维化形成过程中肝星状细胞表达α-SMA增加。随着肝纤维化的进展，α-AR、β1-AR、β2-AR蛋白及mRNA水平明显增加，且与α-SMA呈正相关。

【关键词】  肝硬化； 胆汁淤积； 受体，肾上腺素能； 交感神经系统

Dynamic changes of α-AR, β1-AR and β2-AR expression during hepatic fibrogenesis   LIU Na*, ZHANG Xiao-lan, LIANG Chuan-dong, YAO Dong-mei, LIU Lei, ZHAO Dong-qiang, TIAN Xiao-peng. *Department of Gastroenterology, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China

Corresponding author: ZHANG Xiao-lan, Email: lanz63@ 163.com

【Abstract】    Objective    To investigate the dynamic changes of α-AR, β1-AR andβ2-AR expression in hepatic fibrosis. Methods    Rat hepatic fibrosis model was established by bile duct ligation (BDL). HE and Masson staining were used to determine hepatic fibrosis levels. Immunohistochemistry was applied to detect α-sooth muscle actin (α-SMA), a marker of hepatic stellate cell (HSC) activation; Western blot and real-time RT-PCR were used to measure the dynamic changes of α-AR, β1-AR, β2-AR expression on protein and mRNA levels, respectively, during the development of hepatic fibrosis. Results    (1) HE and Masson trichrome staining showed that the liver fibrosis models were established successfully. (2) At 1, 2, 3, 4 wk after BDL, α-SMA positive area density of the model group (10.58%±1.75%, 24.14%±2.02%, 29.74%±2.59%, 34.28%±2.01%) was significantly higher than that of the sham operation group (4.12%±1.51%), P < 0.01. (3) The expression of α-AR, β1-AR, β2-AR protein and mRNA was increased with the development of the hepatic fibrosis (P < 0.05). (4)α-SMA expression was positively associated with α-AR, β1-AR, β2-AR, r values were 0.564, 0.753 and 0.606, respectively. Conclusions    The expression of α-SMA is increased dramatically during the fibrosis, and is positively associated with the expression of α-AR, β1-AR and β2-AR.

【Key words】Liver corrhosis；Cholestasis；Receptors, adrenergic；Sympathetic nervous system

肝纤维化是各种致病因子引起的慢性肝病，进而发展为肝硬化的一个动态过程[1]。肝硬化患者交感神经系统（sympathetic nervous system，SNS）活性升高、循环血液中儿茶酚胺水平增加。但在肝纤维化形成过程中，交感神经递质去甲肾上腺素各受体亚型的表达情况仍然未知。因此，我们用胆总管结扎法建立胆汁淤积性大鼠肝纤维化模型，探讨去甲肾上腺素各受体亚型的表达与肝纤维化发展的关系，旨在阐明SNS在肝纤维化发生发展中的作用及其机制。

材料与方法

1. 主要试剂：α-肾上腺素受体（α-adreno-ceptor, α-AR）、β1-AR、β2-AR的兔多克隆抗体和β-肌动蛋白山羊多克隆抗体购自美国Santa cruz公司；SP试剂盒购自北京中山生物技术公司；逆转录反应体系、SYBR Green Real Master Mix、Trizol试剂盒购自北京天根生物化学科技有限公司。

2. 动物模型制作及分组：健康雄性Sprague Dawley大鼠50只，清洁级，体质量250～300g，购自河北医科大学实验动物中心（医动字第04057号）。按清洁级大鼠的要求饲养，自由进食水。用胆总管结扎（bile duct ligation，BDL）法制作大鼠肝纤维化模型[2]，将50只雄性Sprague Dawley大鼠随机分成假手术组与1、2、3、4周模型组，每组10只。模型组分别于结扎后1、2、3、4周取肝左叶的相同部位，-20℃保存；假手术组与4周模型组同时取材。

3. 肝组织病理学及α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）检查：肝组织以4%多聚甲醛溶液固定, 石蜡包埋，5μm连续切片，行HE及Masson三色染色；观察肝组织病理学变化及纤维化程度。用SP法进行α-SMA的免疫组织化学染色，操作步骤按试剂盒说明书进行，用麦克奥迪数码医学图像分析系统测量α-SMA的阳性表达情况，以阳性吸光度值计算表达强度。

4. 肝组织蛋白质提取液的制备及Western blot检查：取100mg肝组织提取组织蛋白质，以8%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭；分别以兔抗α-AR、β1-AR、β2-AR多克隆抗体（1∶200）和山羊抗β-肌动蛋白多克隆抗体（1∶200）作为第一抗体；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶5000）或兔抗山羊IgG（1∶5000）作为第二抗体。用增强化学发光（ECL）试剂显色，当条带充分显色后压X光片，结果以目的蛋白与β-肌动蛋白的积分吸光度值（A）的比值表示。密度扫描分析采用美国Kodak公司ID数码成像分析系统软件对Western blot结果进行定量分析，灰度值以A表示。

5. 实时荧光定量PCR检测α-AR、β1-AR及β2-AR的mRNA水平：（1）采用Trizol试剂提取肝组织总RNA，逆转录合成cDNA；α-AR、β1-AR及β2-AR及内参照3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的引物参照GenBank基因序列自行设计，由北京赛百盛基因有限公司合成。引物序列如下：α-AR正义引物为5′-ATCGTGGCCAAGAGGACC-3′，反义为5′-TTTGGCTGCTTTCTTTTC-3′，扩增产物大小201bp；β1-AR正义为5′-ATGGGACTG CTGGTGGTGCC-3′，反义为5′-GAAGGAGAC GACGGACGAGG-3′，扩增产物大小381bp；β2-AR正义为5′-TATCGCTTCCTCTATCGTA TCTTT-3′，反义为5′-AGTTCATTTTCTTT CTCCTGCCCC-3′，扩增产物大小543bp；GAPDH正义为5′-TCCCTCAAGATTGTC AGCAA-3′，反义为5′-AGATCCACAACGG ATACATT-3′，扩增产物大小259bp。（2）在PE5700实时荧光定量PCR仪（购自美国ABI公司）上进行实时定量扩增。PCR反应体积25μl，反应条件：93℃ 5min；93℃ 45s，55℃ 1min，10个循环；93℃ 30s，55℃ 45s，30个循环。用实时荧光定量PCR仪自带软件进行分析，获得产物的循环阈值（Ct）。采用相对定量2-ΔΔCt法比较α-AR、β1-AR及β2-AR基因在各组大鼠肝组织中表达的差异［ΔCt干预组=Ct靶基因－CtGAPDH，ΔCt对照组＝Ct靶基因－CtGAPDH, ΔΔCt=ΔCt靶基因－ΔCt对照组］。

6. 统计学分析：计量资料数据以均数±标准差（x-±s）表示，用SPSS13.0软件进行统计学分析。多组间均数差异性比较采用单因素方差分析及LSD检验；对α-SMA与AR各亚型表达水平进行简单相关分析。

结    果

1. 大鼠纤维化肝组织的组织病理学变化：HE及Masson三色染色显示，胆汁淤积性大鼠肝纤维化模型建立成功，随着造模时间的延长肝纤维化程度逐渐加重。造模4周组大鼠死亡3只，存活率70%。病理学检查可见肝脏广泛纤维结缔组织增生，增生的纤维间隔互相连接、包绕、分割，改建原来的肝小叶甚至形成假小叶。

2. α-SMA免疫组织化学染色：正常大鼠肝组织中仅在血管壁平滑肌细胞有弱阳性表达；随着肝纤维化的发展，大鼠肝组织中α-SMA阳性细胞数明显增多，主要分布于汇管区、纤维间隔、肝窦周围及增生的胆管周围细胞。造模1～4周大鼠肝组织α-SMA的阳性面积分别为10.58%±1.75%、24.14%±2.02%、29.74%±2.59%、34.28%±2.01%，均显著高于假手术组的4.12%±1.51%，F值分别为0.343，0.800，2.400和1.295，P值均＜0.01。见图1（略）。

3. 肝纤维化进程中α-AR、β1-AR、β2-AR蛋白的表达：Western blot分析结果显示，分别在约5.7 ×104、5.0×104、4.7×104位置出现α-AR、β1-AR、β2-AR特异性条带，在4.3 ×104处可见β-肌动蛋白条带（图2略）。假手术组有少量蛋白表达，模型组随着肝纤维化加重其表达量逐渐增加（表1，略）。

4. 肝纤维化进程中α-AR、β1-AR、β2-AR mRNA的表达：在实时荧光定量PCR过程中，以荧光值和循环数作图，自动得到mRNA水平的扩增曲线，可见各样品的重复性较好，扩增效率基本一致。用相对定量2-ΔΔCt法比较α-AR、β1-AR、β2-AR基因在各组大鼠肝组织中的表达情况。结果证实，随着肝纤维化的发展，α-AR、β1-AR、β2-AR mRNA表达水平逐渐上调，见图3（略）与表2（略）。

5. α-SMA与α-AR、β1-AR、β2-AR蛋白表达水平的相关性分析：α-SMA与α-AR呈正相关，r值为0.564；α-SMA与β1-AR、β2-AR也呈正相关，r值分别为0.753、0.606。

讨    论

SNS参与体内各系统的调节，保证器官的正常活动。肝纤维化阶段，肝窦抵抗性增加，肝窦微循环受到相当限制[3]。SNS活性升高可能参与肝纤维化的发生和发展[4]。首先，在CCl4诱导的肝脏损伤模型中，SNS活性增强的自发性高血压大鼠发生的肝纤维化程度比SNS活性正常大鼠更加严重[5]。而且，表达低儿茶酚胺水平或低SNS活性的动物可产生肝纤维化抵抗[6]。这些研究结果均提示SNS的激活以及循环血液中儿茶酚胺水平的提高可以加重肝脏损伤，促进肝纤维化的发生和发展[7]。

但是，SNS活性升高调节肝纤维化进展的机制尚不清楚。已有研究表明，肝硬化门静脉高压症患者肝组织α-AR蛋白和mRNA水平均降低，而循环血液中肾上腺素、去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）浓度均增高。因此，认为受体蛋白的减少对肾上腺素、NE的代谢和效应产生影响，有助于门静脉高压时二者水平的增高。段瑞娴等[8]研究结果显示，血吸虫病肝纤维化小鼠肝组织α1A-AR和β2-AR表达水平增高，同时，血浆中NE及其前体物质多巴胺的水平明显升高。Sancho-Bru等[9]研究表明，随着肝纤维化的进展，肝组织中α1A-AR的表达不受影响，加入α-AR阻滞剂哌唑嗪，NE引起的钙增高峰受抑制，而加入非选择性β-AR阻滞剂普萘洛尔后钙增高峰受抑制不明显。在本研究中，实验性肝纤维化大鼠肝组织中NE各受体的表达在肝纤维化的发展过程中均呈增高趋势，α-AR、β1-AR、β2-AR蛋白及mRNA水平明显增加。说明在肝纤维化的发展过程中，肝组织NE受体表达增加，具体机制可能为：（1）在肝纤维化过程中，SNS活性增高，释放到血液循环中的肾上腺素、NE增多，进一步刺激肝脏AR表达增加，与其相应配体结合，进而在肝纤维化的发生发展过程中发挥一定的作用；（2）肝纤维化过程中肝脏明显受损，肝细胞再生活跃，进一步引起肝脏AR表达增加，以维持SNS的兴奋性；本研究中受体蛋白表达量的增加是否由肝脏损伤引起细胞再生导致的仍需要进一步研究。而且，肝组织中主要细胞成分为肝细胞，随着肝纤维化的进展，肝细胞凋亡增多，数量减少，而肝星状细胞大量增殖、活化，受体表达的增加具体发生在哪个环节仍然需要进一步的探讨。我们前期研究结果表明，NE可以促进体外肝星状细胞的增殖并抑制其凋亡[10]。但是SNS在肝纤维化发生、发展中的具体机制还尚待进一步研究，从而寻求有效的预防和治疗肝纤维化的新策略。

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