【关键词】 肝； 干细胞； 癌，肝细胞； 基因疗法； 血管内皮抑素 Construction and expression of recombinant adenovirus containing secreted endostatin in liver stem cell as a vector for gene therapy ZHONG Xiao-gang, YIN Wu, HUANG Shun-rong, QIN Qian-zi, 【Key words】 Liver; Stem cells; Carcinoma, hepatocellular; Gene therapy; Endostatin 【First author抯 address】 Department of General Surgery, The People抯 Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China Email: zhong.xiaogang@163.com 肝干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能，研究表明肝干细胞为良好的治疗载体细胞，广泛应用于生物型人工肝、肝细胞移植以及先天性代谢性肝病的基因治疗，而近年其在肝癌治疗中的潜力也备受关注。动物实验研究表明，外源性肝干细胞对药物损伤肝脏、对肝癌细胞及病灶均有选择趋向性[1-2]，肝干细胞可望成为靶向治疗的良好基因载体。血管内皮抑素（endostatin，ES）作为抗血管生成重要分子，在肿瘤治疗中极具潜力，通过基因改造获得稳定表达ES的肝干细胞，可望达到靶向抗肝癌血管生成的目的，具有重要的意义。 一、材料与方法 1．材料和试剂：总RNA提取试剂Trizol reagent购自美国Gibco BRL公司，脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司。两步法RT-PCR试剂盒购自成都博瑞克生物技术有限公司, PCR引物合成及质粒测序由上海英骏生物技术有限公司完成，质粒载体pMD-T18、限制性内切酶KpnⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ及T4 DNA连接酶购自日本TaKaRa公司。内切酶PacⅠ、PmeI购自新英格兰 Biology公司。胶回收试剂盒、纯化试剂盒、小剂量质粒提取试剂盒均购自美国Omega公司。大鼠ES酶联免疫吸附试剂盒购自美国Invitrogen公司。 腺病毒AdEasier系统及JM109大肠杆菌由四川大学华西医院病理实验中心惠赠。其中穿梭质粒pAdTrack-CMV带有绿色荧光蛋白（GFP）基因；骨架质粒pAdEasy-1（缺失E1和E3区5型野生型腺病毒基因组质粒）已转化到大肠杆菌BJ5183,命名为pAdEasier。人胚肾293细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所。大鼠肝卵圆细胞株（WB-F344，WB），购自中国科学院药物研究所，由美国Grisham教授科研组建立[3]。细胞均用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液（购自美国Gibco BRL公司）在 2．胞外表达ES腺病毒Ad-ES的构建：从SD大鼠（购自四川大学实验动物中心）肾脏提取RNA，RT-PCR扩增大鼠ES基因；引物设计依据GenBank中大鼠内源性胶原VXIIIcDNA序列（XM_001079576），上游引物：5′-CATA CTCACCAGGACTTTCACCCAG-3′(3598～3622bp),下游引物：5′-AAGCTTCTATTTGGAGAAAGAGGTCATGA AGC-3′ (4127～4152bp)，下划线为加入的HindⅢ酶切位点。扩增产物561bp，连入pMD-18T载体, 构建pMD-ES质粒并测序。再以pMD-Endostatin质粒为模板，采用PCR在大鼠ES基因5′端引入大鼠血清白蛋白信号肽序列（NM_134326，1～60bp）上游引物：5′-GGTACCATG AAGTGGGTAACCTTTCTCCTCCTCCTCTTCATCTCCGG TTCTGCCTTTTCTAGGGGTCATACTCACCAGGA CTTTCACCCAG-3′，下划线为KpnⅠ酶切位点。下游引物与扩增ES基因的相同。扩增产物为611bp，连入pMD-18T载体, 构建pMD-Signal-ES质粒，酶切测序。将pMD-Signal-ES亚克隆到腺病毒载体穿梭质粒pAdTrack-CMV上，得到pAdTrack-Signal-ES；再与已转化到大肠杆菌BJ5183的骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组，得到重组腺病毒质粒pAd-Signal-ES；脂质体LipofectamineTM2000包裹重组病毒质粒DNA后转染293细胞，定期荧光显微镜监测GFP表达和细胞病变现象。收集病毒并反复于293细胞扩增直到所需滴度，命名为重组腺病毒Ad-ES。 3. 胞外表达重组ES的治疗载体肝干细胞的制备：腺病毒按不同感染复数感染肝干细胞WB，筛选表达分泌ES稳定、细胞增殖活力强的细胞继续增殖培养。荧光显微镜下，通过稀释培养，挑选GFP荧光强、表达ES高的肝干细胞WB，扩增培养并筛选出稳定高表达ES、细胞增殖能力强的载体细胞WB-ES，作为治疗性肝干细胞。6孔板中接种培养WB-ES细胞（1×105/孔～5×105/孔），48 h后取上清液，酶联免疫吸附试剂盒检测ES量。提取总RNA，以5′-CATA CTCACCAGGACTTTCACCCAG-3′、5′-AAGCTTC TATTTGGAGAAAGAGGTCATGAAGC-3′为上下游引物，RT-PCR并电泳检测ES-mRNA的表达水平。进一步选择表达ES量最高的细胞株，传代培养观察GFP及ES表达持续时间。 二、结果 1．成功构建重组腺病毒pAd-Signal-ES质粒：用RT-PCR从SD大鼠肾脏扩增ES，构建pMD-ES质粒。采用PCR方法在大鼠ES基因5′端引入大鼠血清白蛋白信号肽序列，并构建含有大鼠血清白蛋白信号肽序列的pMD-Signal-ES，酶切电泳及测序正确（图1）。插入腺病毒载体穿梭质粒,得到pAdTrack-Signal-ES，经同源重组得到重组腺病毒质粒pAd-Signal-ES。 2. 成功包装制备重组腺病毒Ad-ES：重组腺病毒质粒pAd-Signal-ES酶切线性化后转染293细胞，2d后293细胞内可见绿色荧光表达，第7天细胞有明显的绿色荧光表达。10～12d细胞出现明显的病态改变时收集细胞；冻融裂解细胞法得到较高滴度的重组腺病毒，命名为Ad-ES。用100μl重组腺病毒Ad-ES原液经直接再感染293细胞；经细胞扩增、冻溶裂解后浓缩，测定腺病毒的滴度，病毒滴度可达到1×108efu/ml原液。 3．筛选稳定表达分泌型ES的治疗载体肝干细胞WB-ES：肝干细胞WB在RPMI 1640培养液中生长良好，细胞表现为卵圆型小细胞，细胞核也呈卵圆型，核大而胞质少。重组腺病毒Ad-ES成功感染WB细胞，感染12h后可见GFP荧光表达，24h后明显。110100感染复数的感染效率较高，平均约30%～70%，荧光显微镜下细胞形态正常。在培养WB-ES细胞48h后，参照ES酶联免疫吸附试剂盒说明书，用大鼠ES试剂盒检测在治疗细胞WB-ES上清液中ES蛋白水平，结果表明表达稳定。培养48h时上清液中ES蛋白表达水平约3.12～6.31pg/ml。RT-PCR检测ES-mRNA表达，电泳结果显示，内参照3-磷酸甘油醛脱氢酶大小为200bp,其中目的条带大小为561bp，表明治疗细胞WB-ES中有ES的mRNA表达（图2）。采用有限稀释法挑取形态正常、表达ES强的细胞传代培养，获得稳定表达ES的细胞WB-ES；持续的传代培养，细胞胞外表达ES能够维持3～4代。 三、讨论 基因治疗是改善肝癌疗效极具前景的新治疗方法，也是目前研究的热点[4-5]，而肝癌基因治疗主要的难点在于缺乏理想的载体，如何实现基因的靶向高效表达也是肿瘤生物治疗成功的关键。文献报道，外源性肝干细胞对肝癌细胞有趋向能力，用这一特性，将肝干细胞作为细胞载体用于肝癌的靶向基因治疗具有潜在治疗价值。 ES最初是从小鼠成血管瘤培养液中分离的一种内源性糖蛋白，具有强效和选择性抗血管生成作用，通过抑制血管内皮细胞迁移、诱导凋亡、调节血管内皮细胞生长因子的表达起到多靶点作用，导致肿瘤退缩或休眠[6]。将ES转入肝干细胞中表达，并通过这一载体靶向肝癌细胞，可达到选择性在肿瘤局部抗血管生成的目的；理论上由于肝干细胞有强大的自我更新能力，也能起到持续作用和修复创伤的作用。 本研究中，采用基因操作技术将大鼠ES基因序列转入载体，并在其前加入血清白蛋白信号肽序列，以期达到胞外表达的目的；进一步通过腺病毒转染技术，将该重组基因转入肝干细胞中，改造该细胞成为持续表达ES蛋白的治疗细胞。通过细胞培养、检测证实，该细胞稳定表达ES，并分泌入上清液中，细胞可稳定传代。当然上清液中蛋白含量尚较低，能否达到治疗的目的仍需体内、体外实验证实；可能也需要进一步实验筛选更加稳定和高表达ES基因的载体细胞，但实验成功构建可胞外表达ES的载体——肝干细胞，为肝干细胞作为细胞载体靶向抗肝癌血管生成的基因治疗展示了潜在的前景。 参 考 文 献 [1]Zhong XG, He S, Yin W, et al. Selective tropism of liver stem cells to hepatocellular carcinoma in vivo. World J Gastroenterol, 2007, 13: 3886-3891. [2]Zhong XG, He S, Yin W, et al. Tropism of adult liver stem cells toward hepatocellular carcinoma cells in vitro. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 644-647. (in Chinese) 钟晓刚,何生,殷舞,等.成体肝干细胞向肝癌细胞趋向性迁移的体外实验.中华肝脏病杂志,2005,13:644-647. [3]Muller-Borer BJ, Cascio WE, [4]Ruiz J, Mazzolini G, Sangro B, et al. Gene therapy of hepatocellular carcinoma. Dig Dis, 2001, 19: 324-332. [5]Hern醤dez-Alcoceba R, Sangro B, Prieto J. Gene therapy of liver cancer. Ann Hepatol, 2007, 6: 5-14. [6]Folkman J. Antiangiogenesis in cancer therapy--endostatin and its mechanisms of action. Exp Cell Res, 2006, 312: 594-607.
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