【摘要】 目的 观察半乳糖凝集素-3（galectin-3）表达与肝星状细胞增殖和凋亡的关系。 方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测大鼠肝星状细胞中galectin-3 mRNA和蛋白的表达；设计合成galectin-3小干扰片段，筛选有效片段构建质粒；转染大鼠肝星状细胞系rHSC-99，并设立对照组和空质粒转染组, RT-PCR及Western blot检测RNA干扰后galectin-3的表达。活细胞计数法观察干扰后24、48、72h各组细胞增殖情况；Annexin-V/PI 染色，流式细胞仪检测转染72h后各组细胞凋亡情况。组间比较用LSD法t检验进行统计学分析。 结果 rHSC-99细胞表达galectin-3；成功构建pGCsilencer U6/Neo/GFP/shRNA，并经测序验证正确。转染效率为40%～50%，RT-PCR结果显示：RNA干扰组galectin-3 mRNA表达量较对照组下降了52.4%（F＝136.432，P<0.01），Western blot显示RNA干扰组galectin-3蛋白表达量较对照组下降了69.2%（F＝144.842，P<0.01）。干扰后48h和72h时，galectin-3 RNA干扰组细胞增殖较对照组分别下降38.1%（F＝4.425，P＝0.010）和37.5%（F＝4.415，P＝0.018）；干扰72h时，galectin-3 RNA干扰组细胞凋亡率显著高于对照组：早期凋亡率增加155.2%，与对照组比较，F＝27.588，P<0.01；晚期凋亡率增加56.9%，与对照组比较，F＝12.798，P<0.01。 结论 rHSC-99细胞表达galecitn-3；RNA干扰rHSC-99细胞galectin-3的表达能抑制rHSC-99的增殖并促进其凋亡。 【关键词】 肝硬化； 肝星状细胞； 半乳糖凝集素-3； RNA干扰； 细胞凋亡 Effects of galectin-3 on proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells FENG Yi-fei, LI Tao, LI Shu, PENG Ji-run, LENG Xi-sheng. Department of Hepatobiliary Surgery, Peking University People’s Hospital, Correspongding author: LENG Xi-sheng, Email: lengxs2003@ yahoo.com.cn 【Abstract】 Objective To observe the effects of galectin-3 on proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells. Methods RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of galectin 【Key words】Liver corrhosis；Hepatic stellate cells；Galectin-3；Small interfering RNA；Apoptosis 肝星状细胞（HSC）在肝硬化、门静脉高压症发生和发展过程中具有十分重要的作用[1-5]。探索以HSC为靶向的抗肝纤维化治疗新途径成为近年来研究的热点。半乳糖凝集素-3（galectin-3）广泛表达于多种细胞中，参与细胞黏附、分化、迁移、增殖和凋亡等[6-9]。近年的研究结果显示，在实验性肝纤维化模型和肝硬化患者的肝组织中有galectin-3表达的升高[10]。而HSC中是否有galectin-3的表达？galectin-3对HSC的生物学活性有什么影响？我们对此进行了研究。 材料与方法 一、实验材料 1. 细胞系：实验组细胞为本实验室建立的大鼠肝星状细胞系rHSC-99[11]。对照应用大鼠肝细胞株BRL，由上海生命科学院细胞库提供。 2. 主要试剂及设备：Trizol总RNA提取试剂盒购自美国Gibco公司；逆转录试剂盒及DNA聚合酶 Mix购自美国Promega公司；引物由上海生工生物工程公司合成；真核表达载体pGCsilencer U6/Neo/GFP/shRNA由上海吉凯公司构建并鉴定；质粒抽提试剂盒购自美国Qiagen公司；细胞转染试剂Lipofectamine 2000TM购自美国Invintrogen公司；Bradford试剂盒购自武汉博士德公司；小鼠抗大鼠galectin-3单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠第二抗体购自北京中杉公司；细胞增殖检测试剂（活细胞计数法）购自上海同仁化学研究所；Annexin V细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司；酶标仪购自美国Bio Rad公司；流式细胞仪购自美国BD公司。 二、 方法 1. 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测大鼠肝星状细胞中galecin-3 mRNA的表达：大鼠肝细胞为对照；总RNA提取和逆转录反应按试剂盒说明书进行操作；大鼠galectin-3及内参照β-肌动蛋白引物、扩增片段长度见表1; PCR反应条件: 2. Western blot检测大鼠肝星状细胞中galecin-3蛋白的表达：以大鼠肝细胞为对照，β-肌动蛋白为内参照：收集细胞，瑞斯托霉素诱发血小板凝集反应裂解法提取细胞总蛋白；考马斯亮蓝法测定样本蛋白浓度；取20μg胞质蛋白以12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至硝酸纤维素膜,脱脂奶粉封闭后分别加入第一、第二抗体孵育,电化学发光试剂显色,全自动图像分析仪测定条带灰度。 3. 小RNA干扰片段合成及质粒的构建和鉴定：galectin-3 RNA干扰片段的设计、合成、筛选及质粒的构建、测序由上海吉凯公司完成，有效干扰靶点为大鼠galectin-3 mRNA第816位，载体构建框架序列：正义链为5′-CACGCCATGATCTAA GCCAGA-3′，反义链为5′-TCTGGCTTAGATC ATGGCGTG-3′。 4. 细胞转染和干扰效率验证：设立对照组、空质粒组和galectin-3 RNA干扰组。质粒转染按Lipofectamine 2000TM产品说明书进行, 72h后收集细胞。RT-PCR半定量及Western blot检测干扰后galectin-3的表达，全自动图像分析仪测定条带灰度，以galectin-3/β-肌动蛋白比值来表示相对表达量。 5. 活细胞计数法观察干扰后24、48、72h的细胞增殖情况：消化细胞并调整细胞数, 按细胞数1×104/孔接种于96孔板。设对照组、空质粒组和galectin-3 RNA干扰组；每组设18个孔，以不加细胞的孔作为空白对照孔。参照Lipofectamine 2000说明书进行转染。分别于干扰后24、48、72h取6孔/组，加入活细胞计数试剂10μl/孔孵育2h，在酶标仪上测定各孔450nm吸光度(A450)值。 6. Annexin V-FITC/PI双染色检测细胞凋亡：干扰72h,收集分组处理的细胞后，磷酸盐缓冲液洗涤，重悬于200μl结合缓冲液（Binding Buffer），加入10μl Annexin-V-FITC冰上染色，上机前5min加入5μl 碘化丙啶及300μl结合缓冲液，混匀室温避光静置5min, 流式细胞仪检测凋亡。 4. 统计学分析：结果以均数±标准差（x-±s）表示，应用SPSS11.0软件进行one way ANOVA方差分析，组间比较用LSD法t检验。 结 果 1. RT-PCR及Western blot均证实肝星状细胞表达galectin-3，见图1,2。 2. 成功构建质粒pGCsilencer U6/Neo/GFP/shRNA，并经测序鉴定正确（图3）。 3. 质粒转染和干扰效果验证结果：成功转染了质粒pGCsilencer U6/Neo/GFP/shRNA, 荧光显微镜下估算转染效率为40%～50%。RT-PCR结果显示galectin-3 RNA干扰组galectin-3 mRNA表达量较对照组降低了52.4%（F＝136.432，t＝14.523，P<0.01）,见图4；Western blot显示galectin-3 RNA干扰组galectin-3蛋白的表达量与对照组相比降低了69.2%（F＝144.842，t＝14.934，P<0.01)，见图5。而空质粒组和对照组mRNA和蛋白表达量差异均无统计学意义（表2）。 4. 活细胞计数法检测各组细胞增殖结果：干扰后24、48、72h各组细胞继续生长，24h时各组细胞增殖无明显差异，48h和72h时，galectin-3 RNA干扰组细胞增殖率较对照组分别下降38.1%（F＝4.425，t＝2.963，P＝0.010）和37.5%（F＝4.415，t＝2.661，P＝0.018)。对照组和空质粒组各时间段增殖差异均无统计学意义(表3)。 5. Annexin-V测细胞凋亡结果：质粒转染72h时，galectin-3 RNA干扰组细胞凋亡率显著高于对照组：早期凋亡率增加155.2%，与对照组比较，F＝27.588，t＝6.979，P<0.01；晚期凋亡率增加56.9%，与对照组比较，F＝12.798，t＝4.994，P<0.01。早期凋亡率高于晚期凋亡率（t＝5.574，P<0.01）。而对照组和空质粒组早期凋亡率和晚期凋亡率差异均无统计学意义，见表4，图6。 讨 论 HSC在肝硬化、门静脉高压症发生和发展过程中具有十分重要的作用[1-5]。激活的HSC大量增殖，表达多种细胞因子，并产生胶原纤维等细胞外基质参与肝纤维化的形成。从另一个角度来看，肝脏损伤时，HSC的激活和产生胶原纤维是机体对损伤的反应，对肝脏损伤的修复是有益的。但是，HSC的持续激活、分泌细胞因子和大量的细胞外基质在肝脏沉积，不但加重了肝损伤，而且促进了肝纤维化的发生和发展。HSC完全活化后其表型不易逆转，但活化的HSC会出现自发性凋亡。HSC自发性凋亡比例很小，并不能完全逆转肝纤维化[4-5]。因此，如果在抑制活化的HSC增殖的同时促进其凋亡，无疑将有助于减轻肝纤维化。 galectin-3是动物血凝素Lectin家族成员之一, 因与含β-半乳糖苷残基的糖复合物具有很高的亲和力而得名[12]。galectin-3广泛表达于多种细胞中，参与细胞黏附、分化、迁移、增殖和凋亡等[6-9]。研究结果显示，在实验性肝纤维化模型和肝硬化患者的肝组织中有galectin-3表达的升高[10]。此外，在galectin-3基因敲除的galectin-3-/-小鼠中，尽管存在致肝损伤的因素和炎症反应，但其肝纤维化的程度要比野生型小鼠轻得多[10]。这说明galectin-3可能在肝纤维化过程中起了重要作用。HSC是否表达galectin-3以及galectin-3对HSC的生物学活性又有什么影响尚需进一步研究。 本研究证实了HSC在mRNA和蛋白水平均表达galectin-3，并成功地构建了含galectin-3的RNA干扰载体。转染HSC后，进一步观察galectin-3与HSC增殖和凋亡的关系，结果表明降低HSC中galectin-3的表达水平可以促进HSC的凋亡。本研究结果提示HSC表达galectin-3；并通过调节HSC中galectin-3的表达可以抑制HSC的增殖并促进其凋亡。因此，galectin-3是有研究前景的抗肝纤维化治疗靶点之一。 在实体环境中，HSC与库普弗细胞之间可通过旁分泌和自分泌作用相互影响[13]。那么库普弗细胞是否能表达galectin-3、RNA干扰抑制galectin-3表达对HSC和库普弗细胞共培养体系中细胞增殖和凋亡是否有影响？我们将对此做进一步探讨。 参 考 文 献 [1]Friedman SL. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev, 2008, 88: 125-172. [2] [3]Saile B, Ramadori G. Inflammation, damage repair and liver fibrosis--role of cytokines and different cell types. Z Gastroenterol, 2007, 45: 77-86. [4]Reynaert H, Thompson MG, Thomas T, et al. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut, 2002, 50: 571-581. [5]Parsons CJ, Takashima M, Rippe RA. Molecular mechanisms of hepatic fibrogenesis. J Gastroenterol Hepatol, 2007, 22 Suppl 1: S79-84. [6]Lippert E, Falk W, Bataille F, et al. Soluble galectin-3 is a strong, colonic epithelial-cell-derived, lamina propria fibroblast-stimulating factor. Gut, 2007, 56: 43-51. [7] [8]Nishi Y, Sano H, Kawashima T, et al. Role of galectin [9]Nangia-Makker P, Nakahara S, Hogan V, et al. Galectin [10] [11]Leng XS, Weng SG, Li T, et al. Establishment of a new rat hepatic stellate cell line rHSC-99 with characteristics of myofibroblast cell. Jiepou Xuebao, 2003, 34: 269-274. (in Chinese) 冷希圣，翁山耕，李涛,等.大鼠肝星状细胞系的建立及其生物学特性的研究.解剖学报,2003,34:269-274. [12]Barondes SH, Cooper DN, Gitt MA, et al. Galectins. Structure and function of a large family of animal lectins. J Biol Chem, 1994, 269: 20807-20810. [13]Moreira RK. Hepatic stellate cells and liver fibrosis. Arch Pathol Lab Med, 2007, 131: 1728-1734.
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