【摘要】 目的 观察超级白细胞介素-6重组慢病毒对人正常肝细胞L-02的促增殖作用。 方法 利用慢病毒表达质粒及其包装系统构建超级白细胞介素-6重组慢病毒（FIV-Hyper-IL-6）、IL-6重组慢病毒（FIV-IL-6）和空慢病毒载体（FIV），用嘌呤霉素筛选的方法测定其病毒滴度。将人肝细胞L-02分为4组：FIV-Hyper-IL-6组、FIV-IL-6组、FIV组及未感染组，各组分别感染其相应的重组慢病毒，采用四甲基偶氮唑盐法检测其对L-02细胞生长状态的影响；并用RT-PCR法检测重组慢病毒感染L-02细胞后产生的急性时相蛋白-结合珠蛋白mRNA 表达量的变化。应用方差分析进行统计学分析。 结果 构建出的各重组慢病毒能成功感染靶细胞，嘌呤霉素筛选法测得的各重组慢病毒的病毒滴度均为107pfu/ml。病毒颗粒感染L-02细胞后48h，细胞的促增殖作用（A值）FIV-Hyper-IL-6组为0.6267±0.0256，FIV-IL-6组、FIV组及未感染组分别为0.5563±0.0112、0.5040±0.0078、0.4790±0.0201，F＝41.09，P值均<0.01，且随着时间的延长，对细胞的促增殖作用有所增加，并于感染后72h达到最高，为0.8000±0.0166。FIV-Hyper-IL-6组细胞结合珠蛋白mRNA吸光度值为0.7030±0.0106，FIV-IL-6组、FIV组及未感染组分别为0.3355±0.0093、0.1143±0.0153、0.1145±0.0076，q＝57.5007，P值均<0.01。 结论 构建的Hyper-IL-6重组慢病毒能够显著刺激L-02细胞表达结合珠蛋白，对L-02细胞有较强的促增殖作用。 【关键词】 肝细胞； 白细胞介素-6； 慢病毒属； 触珠蛋白类 The influence of the recombinant lentiviral vectors encoding Hyper-IL-6 on the proliferation of human hepatic cell SUN Wen-jing, QIN Bo, HUANG Tao, HUANG Ai-long. Department of Infection Disease, First Affiliated Hospital, Corresponding author: QIN Bo, Email: cqqinbo@126.com 【Abstract】 Objective To investigate the effect of Hyper-IL-6 on the proliferation of L-02 cells. Methods The recombinant lentiviral vectors encoding Hyper-IL-6 (FIV-Hyper-IL-6), IL-6 (FIV-IL-6) and the lentiviral (FIV) were prepared using the FIV-based lentiviral vectors and the packaging system. The titer of FIV-Hyper-IL-6, FIV-IL-6 and FIV was tested with puromycin. L-02 cells were infected with FIV-Hyper-IL-6, FIV-IL-6, FIV, or mock-infected. The growth rate of L02 cells was analyzed with MTT at different time points after infection. The changes of Haptoglobin in L-02 cells were analyzed with RT-PCR. Results FIV-Hyper-IL-6, FIV-IL-6 and FIV were successfully constructed, and the titer was 107 pfu/ml. 48 hours after infection, the absorbance of the cells infected with FIV-Hyper-IL-6 was 0.6267±0.0256, and the absorbances of FIV-IL-6 infected cells, FIV infected cells and mock-infected cells were 0.5563±0.0112, 0.5040±0.0078 and 0.4790±0.0201, respectively. There were significant differences between the FIV-Hyper-IL-6 group and the other groups (F = 41.09, P < 0.01). The ratio of the absorbance between haptoglobin mRNA and beta-actin was 0.7030±0.0106, 0.3355±0.0093, 0.1145±0.0076 and 0.1143±0.0153, respectively, in FIV-Hyper-IL-6 infected cells, FIV-IL-6 infected cells, FIV infected cells and mock-infected cells. There were significant differences between the FIV-Hyper-IL-6 group and the others (q = 57.5007, P < 0.01). Conclusion Compared with IL-6, Hyper-IL-6 is more potent to stimulate proliferation and induce the expression of Haptoglobin in L-02 cells. 【Key words】 Hepatocyte; Interleukin-6; Lentivirus; Haptoglobins 超级白细胞介素-6（hyper-interleukin-6，Hyper-IL-6）是白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）与可溶性白细胞介素6受体（soluble interleukin-6 receptor，sIL-6R）连接形成的一种融合蛋白。具有超高效IL-6活性，可直接激活跨膜信号转导蛋白gp130，促进细胞表面信号转导复合物的形成，进而调节细胞的增殖和分化，增强人类肝细胞的再生能力[1]。在肝细胞受损伤时，IL-6可以诱导结合珠蛋白的合成，后者在急性期反应中扮演重要的保护角色[2]。我们课题组已完成了Hyper-IL-6融合基因的构建[3]。如何将外源的Hyper-IL-6导入肝细胞内进行表达，达到促肝细胞再生,有利于肝衰竭的恢复的目的，是基因治疗所面临的重要选择。我们采用最新研制的慢病毒表达系统构建了重组Hyper-IL-6慢病毒载体，建立了稳定表达Hyper-IL-6的肝细胞基因转染模型，并系统的研究Hyper-IL-6重组慢病毒对人类肝细胞的促增殖作用的影响，为进一步探讨Hyper-IL-6在肝细胞再生中可能的分子机制和临床应用前景打下一定基础。 材料与方法 一、材料 pCDIIL-6由国家人类基因组北方研究中心马大龙教授惠赠，含有完整的人类IL-6编码区cDNA序列。慢病毒表达质粒及其包装系统pPACKF1TM购自美国SBI公司。大肠杆菌DH5α、HepG2细胞、人胚肾293T细胞和人肝细胞L-02为重庆医科大学病毒性肝炎研究所保存。小剂量总RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司。逆转录试剂盒购自立陶宛Fermentas公司。高保真DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅠ、BglⅡ、核酸分子量标准、PCR产物纯化试剂盒、T4连接酶购自大连宝生物TaKaRa公司。脂质体转染试剂盒购自美国Invitrogen公司。DNA胶回收试剂盒购自美国Omega公司。Polybrene、四甲基偶氮唑盐（MTT）及DMSO购自美国Sigma公司，嘌呤霉素购自美国Amresco公司。 二、方法 1. Hyper-IL-6融合基因的构建：根据人类IL-6和sIL-6R的基因序列，设计合成4条引物：P1：5′-GTCAGATCTATGCTGGCCGTCGGCTGC-3′为sIL-6R的上游引物，划线部分为BglⅡ酶切位点；P2：5′-CTCGACTGACCCTCCACCTCCTGATC CACCACCGCGAGCTGGAGGACTCCTGGATTCT-3′为sIL-6R的下游引物，斜体部分为编码疏水性多肽Linker的DNA序列；P3：5′-CGCGGTGGTGG ATCAGGAGGTGGAGGGTCAGTCGAGCCA GTACCCCCAGGAGAAGATT-3′位IL-6的上游引物；P4：5′-CCGGAATTCCTACATTTGCCGAAG AGCCCTC-3′位IL-6的下游引物，划线部分位为EcoRⅠ酶切位点。HepG2细胞常规培养，待细胞生长至60%融合时，加入1μmol/L的地塞米松刺激18h[4]。用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤2次后收集细胞，提取总的mRNA，以此为模板进行反转录。采用基因拼接法以反转录产物和质粒pCDIIL-6为模板，用引物P1、P2、P3及P4做PCR反应，扩增出1560bp的基因产物[5]。取上述PCR产物及慢病毒表达质粒经限制性内切酶EcoRⅠ、BglⅡ双酶切后，克隆至慢病毒表达质粒中，并在大肠杆菌DH5α中扩增并提取质粒，以构建重组慢病毒表达质粒-Hyper-IL-6。并对其经EcoRⅠ和BglⅡ酶切、PCR及测序鉴定。同时，EcoRⅠ和BglⅡ双酶切质粒pCDIIL-6后，定向克隆至慢病毒表达质粒中，构建重组慢病毒表达质粒-IL-6表达质粒作为对照。 2. Hyper-IL-6重组慢病毒的构建：293T细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中。转染前1d，将3.75×106个/孔293T细胞接种于 3. 慢病毒滴度测定及靶细胞内Hyper-IL-6 mRNA的表达：将收集到的上述病毒储存液进行倍比稀释，稀释的终浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10。将293T细胞分为3组：（1）FIV-Hypr-IL-6组，用以测定FIV-Hyper-IL-6重组慢病毒颗粒的病毒滴度；（2）FIV-IL-6组，用以测定FIV-IL-6重组慢病毒颗粒的病毒滴度；（3）FIV组，用以测定空慢病毒载体的病毒滴度；各组均按5×105细胞/孔分别接种于24孔板中，于细胞生长至融合70%时感染稀释后的重组慢病毒，各稀释后的终浓度做3个复孔，并加入终浓度为8μg/ml的多聚季胺。 将FIV-Hyper-IL-6感染HepG2细胞，48h后收集细胞，提取总的mRNA，逆转录cDNA，加入特异性引物，PCR扩增后行凝胶电泳检测，分析Hyper-IL-6基因在靶细胞内mRNA表达情况。 4. Hyper-IL-6重组慢病毒对人正常肝细胞的促增殖作用：将人肝细胞L-02按5×103个细胞数分别接种于96孔板，分为4组：（1）FIV-Hyper-IL-6组，感染FIV-Hyper-IL-6重组慢病毒；（2）FIV-IL-6组，感染FIV-IL-6重组慢病毒；（3）FIV组，感染空慢病毒载体FIV；（4）未感染组，为阴性对照组，未感染重组慢病毒载体。每组3个复孔。常规培养细胞，待细胞生长至汇片70%时，各组分别感染重组慢病毒。于感染后48、72、96h收集细胞，用MTT法测定各孔的吸光度值。并于感染后48h提取各组细胞的总的mRNA，经反转录后，以反转录产物为模板，用结合珠蛋白特异性引物进行PCR反应，同时以β-肌动蛋白作为内参照，RT-PCR反应法检测结合珠蛋白mRNA表达的变化。结合珠蛋白特异性引物为Hb1：5′-TGGCTGCTGACCACGG CTAA-3′，Hb2：5′-CGCATCGCCATAGCAG GTGT-3′。β-肌动蛋白特异性引物为β-肌动蛋白1：5′-CAAAGACCTGTACGCCAACA-3′；β-肌动蛋白2：5′-GAAGCATTTGCGGTGGAC-3′。 5. 统计学分析：计量资料以均数±标准差（x-±s）表示，对感染重组慢病毒后L-02细胞的结合珠蛋白mRNA表达分析采用单因素方差分析，对重组慢病毒感染后对L-02细胞的促增殖作用采用两因素析因设计资料的方差分析，P<0.01表示差异有统计学意义。所有资料应用SPSS15.0统计软件进行数据分析。 结 果 1. Hyper-IL-6融合基因的构建：Hyper-IL-6基因克隆至重组表达质粒后，用EcoRⅠ和BglⅡ酶切出1500bp左右的片段，行PCR反应也扩出约为1500bp大小的片段，与预期的大小相符。测序结果表明，Hyper-IL-6基因准确地插入到慢病毒重组表达质粒，见图1。 2. Hyper-IL-6重组慢病毒的构建：转染12h后，即可在荧光显微镜下观察到散在的少量明亮的绿色荧光。随后表达绿色荧光蛋白的细胞逐渐增多，荧光强度也逐渐增加。从而建立了FIV-Hyper-IL-6重组慢病毒系统的包装细胞系,见图2。 3. 重组慢病毒滴度的测定及靶细胞内Hyper-IL-6 mRNA的表达：重组慢病毒感染293T细胞并经嘌呤霉素筛选后，观察发现各组中重组慢病毒所感染的细胞在病毒储存液稀释为10-3时开始出现细胞死亡，10-7时约70%的细胞死亡，10-8、10-9、10-10时细胞全部死亡。最终所测得的FIV-Hyper-IL-6、FIV-IL-6和FIV病毒滴度均为107pfu/ml。 FIV-Hyper-IL-6感染HepG2细胞48h后，荧光显微镜下观测到HepG2细胞内含有绿色荧光，证实重组慢病毒已感染了该细胞。收集HepG2细胞，提取总的mRNA，RT-PCR扩增后，1%凝胶琼脂糖电泳结果，见图3。 4. Hyper-IL-6重组慢病毒对人正常肝细胞的促增殖作用：感染不同的重组慢病毒后在不同的作用时间上对细胞的促增殖作用有差异有统计学意义，F=7.85，P<0.01。L-02细胞感染FIV-HIL-6后，细胞的增殖活性高于其余各组（P值均<0.01），且随着时间的延长，重组慢病毒对细胞的促增殖作用有所增加，感染FIV-HIL-6重组慢病毒后于72h细胞的增殖活性达到最高（0.8000±0.0166）。但在感染后96h对细胞的促增殖作用有所减缓（0.7320±0.0125）, 见表1。 于感染后48h收集细胞，电泳结果显示，各组均有结合珠蛋白mRNA的表达，结合珠蛋白和β-肌动蛋白的条带分别为488bp和255bp，与设计的大小一致，见图4。测定各条带的吸光度值，其结果以结合珠蛋白条带的光密度值/β-肌动蛋白条带的吸光度值表示。FIV-Hyper-IL-6组为0.7030±0.0106、FIV-IL-6组为0.3355±0.0093、FIV组为0.1143±0.0153、未感染组为0.1145±0.0076，细胞的结合珠蛋白mRNA表达明显高于其他各组，q＝57.5007，P值均<0.01，差异有统计学意义。 讨 论 IL-6是一种多效性的细胞因子，在肝细胞再生过程中扮演重要角色，它通过与跨膜信号转导蛋白gp130亚单位结合形成受体复合物而产生效应，从而活化Janus激酶/信号转导活化转录因子信号转导途径。IL-6可能通过帮助肝细胞进入一种复制感受态，以便肝细胞能够对生长刺激因子（如肝细胞生长因子、转生化长因子α等）产生应答，因此，IL-6及其在体内经Janus激酶/信号转导活化转录因子的信号转导途径在肝细胞再生过程中担负着极其重要的生物学作用[1，6]。Hyper-IL-6是由IL-6与sIL-6R通过富含甘氨酸的连接肽连接而形成一种新的融合蛋白，具有超高效IL-6活性，可直接激活跨膜信号转导蛋白gp130，促进细胞表面信号转导复合物的形成，进而调节细胞的增殖和分化，增强人类肝细胞的再生能力[7-8]。Hyper-IL-6超高效的生物活性与肝细胞表面gp130与IL-6R的表达差异有关。研究表明，肝细胞膜表面gp130的表达远远超过特异性IL-6R。在没有IL-6R存在的情况下，IL-6不能单独与gp130结合而发挥作用。而Hyper-IL-6可直接与gp130结合并启动后续的信号转导途径而发挥促肝细胞增殖的活性[9]。 本研究中，我们采用基因拼接法构建融合基因Hyper-IL-6，并将其定向克隆至慢病毒表达载体pCDF cDNA表达质粒上[10-11]；然后与包装系统所组成的三质粒系统瞬时共转染293T细胞中得到了完整的病毒颗粒，并采用嘌呤霉素筛选方法测定病毒颗粒的滴度，病毒的滴度达到了107pfu/ml。 我们进一步用MTT法对重组慢病毒在体外培养人肝细胞L-02的促增殖作用进行了研究，发现L-02细胞感染后，重组慢病毒载体表达的目的基因对细胞的促增殖作用有明显的不同。Hyper-IL-6对细胞促增殖作用明显大于其他各组，而且随着时间的延长，细胞的促增殖活性也有所增加，于感染后72h对细胞的增殖活性达到最高峰，感染后96h对细胞的促增殖作用有所减缓，这可能与体外培养时，细胞数量达饱和密度后停止增殖有关。我们的研究结果还表明，当重组慢病毒感染L-02细胞时，其表达的Hyper-IL-6对刺激结合珠蛋白mRNA表达的能力大于IL-6的能力，说明Hyper-IL-6在促进肝细胞增殖方面较IL-6具有较高的活性，与国外学者研究结果相符[12-14]。 目前Hyper-IL-6促细胞生长与增殖作用的机制尚不完全清楚，重型肝炎的治疗还面临诸多困难。本研究对Hyper-IL-6的促肝细胞增殖作用进行了初步探讨并取得了令人鼓舞的结果，这为我们进一步探索Hyper-IL-6在重型肝炎肝细胞再生中的机制及临床应用前景奠定了一定基础。 参 考 文 献 [1]Qie CH, Qin B. 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