【摘要】 目的 探讨携带多药耐药基因1（multidrug resistance gene 1，mdr1）反义RNA的重组腺病毒载体靶向逆转甲胎蛋白阳性（AFP+）的肝癌多药耐药细胞HepG2R的疗效及作用机制。 方法 分别构建携带AFP启动子和mdr1基因反义核苷酸片段的重组腺病毒载体Adeno-asmdr及携带AFP启动子和增强绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体Adeno-EGFP，将Adeno-EGFP转染人正常肝细胞L02（AFP-）、人宫颈癌细胞HeLa（AFP-）及HepG2（AFP+）细胞，检测增强绿色荧光蛋白基因在各细胞的转录水平；将Adeno-asmdr转染HepG2R细胞，Western blot检测不同时间P-gp170的表达，末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法检测HepG2R细胞凋亡，流式细胞术检测HepG2R细胞在不同药物作用下细胞周期、凋亡率。 结果 增强绿色荧光蛋白基因在AFP阳性的HepG2细胞可得到显著转录，而在L02细胞和HeLa细胞，其转录减少，显示了该载体的良好转录活性以及靶向特异性。Adeno-asmdr转染HepG2R细胞后，HepG2R细胞P-gp170表达明显减弱，HepG2R细胞凋亡增加，HepG2R细胞对多种化疗药物的耐受能力明显下降，细胞出现显著的周期阻滞，大量细胞被阻滞于S期和G0/M期，凋亡细胞比例增加。 结论 实验构建的Adneo-asmdr重组腺病毒载体可在AFP阳性HepG2R细胞内特异靶向性表达目的基因，并可有效降低mdr1基因产物P-gp170的表达，从而达到对HepG2R细胞多药耐药的逆转作用。 【关键词】 癌，肝细胞； 腺病毒； 反义技术； 多药耐药基因1 Reversal of multidrug resistance in hepatocellular cell line HepG2R by mdr1-antisense RNA MEI Ying*, SHI Yu-jun, DING Xiong, JIAN Hua-gang, GONG Jian-ping, LIU Chang-an, CHEN Xiao-guang. *The Seconed Affiliated Hospital of Corresponding author: CHEN Xiao-guang, Email: 32955@126.com 【Abstract】 Objective To investigate whether multidrug resistance gene 1(mdr1) could reverse multidrug resistance (MDR) in HepG2R cells. Methods An adenovirus vector, Adeno-asmdr, containing the antisense RNA driven by AFP promoter, was construct. Adeno-EGFP was transfected into HepG2, an AFP producing cell line, L02, a normal human liver cell line, and HeLa, a human cervical cancer cell line, the EGFP transcription level was detected by RT-PCR. Adeno-asmdr was transfected into HepG2R cells, the expression of P-gp170 was detected by western blotting, apoptosis was detected using TUNEL and flow cytometry, cell cycle was analyzed by flow cytometry. Results EGFP was highly expressed in HepG2 cells, however, its expression in L02 or HeLa cells was very weak. Western blot showed that the P-gp170 was marked down-regulated 48h after transfection with Adeno-asmdr, and the expression of P-gp170 was detectable at least 7d post-transfection. Compared with control cells, Adeno-asmdr transfected HepG2R cells were more sensitive to different chrmicals, as indicated by TUNEL staining and flow cytometry. Chemical treatment arrested the cells in S and G0/M phase. Conclusion The recombinant adenoviral vector, Adeno-asmdr, can block the expression of mdr1, and reverse MDR in HepG2R cells. 【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Adenovirus; Antisense technology; Multidrug resistance gene 1 肝癌恶性程度高，预后极差，对放射治疗及化学治疗均极不敏感[1]。肝癌化学治疗失败的主要原因是肝癌细胞对多种化学治疗药物极不敏感，而肝癌细胞与化学治疗药物耐受相关基因的高转录和表达是肝癌细胞耐药的主要原因，这些基因主要是多药耐药基因1（multidrug resistance gene 1，mdr1）和多药耐药相关蛋白基因等，其中mdr1的作用显得尤为重要[2]。本研究运用基因技术，构建携带mdr1反义RNA重组腺病毒载体，可封闭表达甲胎蛋白（AFP）的肝癌多药耐药细胞HepG2R，下调P-gp170的高表达，恢复肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，诱导肿瘤细胞凋亡，并初步证实了其靶向性。 材料与方法 1．细胞系：人肝癌细胞系HepG2、人正常肝细胞系L02、人宫颈癌细胞系HeLa由本室长期保存，低传代人胚肾293细胞（HEK293）购自中科院上海细胞及生化研究所。多药耐药细胞HepG2R由本室构建并保存[3]。细胞均在 2．试剂：EX tap DNA聚合酶、T4连接酶、DNA提取试剂盒、质粒抽提试剂盒购自美国Promega公司；限制性内切酶、DNA分子标记购自大连宝生物工程有限公司；LipofectamineTM reagent转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国Sigma公司，RPMI 1640、胎牛血清购自美国Hyclone公司，DMEM培养液购自美国Gibco公司，小鼠抗人P-gp170抗体购自美国Chemicon公司。 3．重组腺病毒载体：去除腺病毒载体系统（Adeno-XTM Expression System，购自美国Clontech公司）穿梭质粒pshuttle中的pCMV启动子、将AFP启动子插入pshuttle中原巨细胞病毒（CMV）启动子的区间，得到以AFP启动子代替CMV 启动子的穿梭质粒pAFP，以pEGFP-C1（购自美国Clontech公司）作为模板，PCR扩增增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced green fluorescence protein，EGFP），并将EGFP基因亚克隆至pAFP中，构建质粒pAFP-EFGP[4-5]。从耐药细胞HepG2R提取总RNA，经逆转录合成首条cDNA，然后进行PCR扩增从转录起始点开始200bp的mdr1。将PCR产物于pAFP质粒同时以KpnⅠ和ApaⅠ进行双酶切后，以T4连接酶连接。这样即将mdr1转录起始位点后200 bp片段反向插入pAFP，构建成pAFP-asmdr质粒[6]。将质粒pAFP-EFGP和pAFP-asmdr质粒分别以内切酶PI-SceⅠ/I-CeuⅠ进行双酶切，回收酶切产物；运用体外连接（in vitro ligation）方案，将上述酶切后的质粒亚克隆至腺病毒基因组Adeno-XTM将连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue，挑选阳性克隆，提取足够量重组pAdeno-X DNA，以PacⅠ消化pAdeno-X DNA，使其线性化，转染HEK293细胞。按照终点稀释法测定出本实验病毒滴度约为1×107pfu/ml。转染靶细胞前先将细胞培养于6孔培养板，24h后吸尽培养液，以100pfu/ml滴入病毒，培养4h后加入完全培养基，再常规培养24h后进行相关指标检测。 4． 转染Adeno-EGFP、Adeno-asmdr对HepG2细胞生长曲线的影响：锥虫蓝拒染法：取对数生长期HepG2细胞，用DMEM培养液调整成1×104/ml细胞悬液，分别接种于6孔培养板，每孔2 ml。细胞分为Adeno-EGFP转染组、Adeno-asmdr转染组和非转染组，腺病毒用量为100pfu/ml。各孔设6个平行孔，于转染后24、48、72h和7d、取各组细胞，PBS洗2次，胰酶消化后制成单细胞悬液，0.4%锥虫蓝染色后计数。取各组均数绘制细胞生长曲线。 5. RT-PCR检测EGFP转录水平：应用Primer5软件设计RT-PCR反应的引物；EGFP上、下游引物序列分别为：5′-AAGGGCCCTTTAGTGAACC GTCAGAT-3′和5′-GCCTTAAGTTATCTAGAT CCGGTGGAT-3′，产物为540bp。β-肌动蛋白作为内参照，上、下游引物序列分别为：5′-ACCACA GCTGAGGGAAATCG-3′和5′-AGAGGTCTT TACGGATGTCAACG-3′，产物为281bp。以上引物均由上海博亚生物公司合成。将HepG2、L02和HeLa细胞分别以4×104个/孔接种于6孔培养板，待细胞生长至覆盖培养板底面50%～70%，弃培养液；加入含Adeno-EGFP的培养液至细胞表面，轻轻摇动以覆盖细胞；继续培养4h；加入新鲜完全培养液，继续培养；48h后行RT-PCR检测；取RT-PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳，在Doc Gel 2000（Bio-Rad）凝胶成像系统下成像并以Bio-Image Analysis System进行半定量检测，结果以吸光度（A）值×面积（S）表示。mRNA相对含量＝（A目的基因×S）/（Aβ-肌动蛋白×S）。 6．检测Adeno-asmdr对HepG2R细胞多药耐药的逆转效果：Western blot检测转染前后HepG2R细胞P-gp170蛋白表达情况将细胞分为5组，分别取转染后0、24、48、72h和7d的细胞，提取膜蛋白，检测P-gp170表达水平，并设立HepG2细胞组作对照。末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡，所需溶液配制及主要步骤参照试剂盒说明进行。流式细胞术检测不同药物作用下细胞周期和凋亡率的改变：取对数生长期HepG2R转染前、转染后48h细胞，分别加入对HepG2R半数抑制剂量（IC50）的阿霉素、5-氟尿嘧啶和紫杉醇，作用24h；以未作任何处理的HepG2细胞作为空白对照；0.25%胰酶消化，离心，PBS洗涤细胞2次，将细胞尽量吹打成单细胞悬液，70%冰乙醇固定；上机前，重新以PBS洗涤细胞2次，将等体积的细胞悬液与碘化丙啶（PI）混匀， 结 果 1. 转染腺病毒对HepG2细胞生长曲线的影响：加入腺病毒后，细胞生长曲线无明显改变，证明腺病毒对细胞生长未产生明显抑制作用（图1）。 2．RT-PCR检测Adeno-EGFP转染HepG2、L02以及HeLa细胞后EGFP基因转录水平：将Adeno-EGFP转染HepG2、L02以及HeLa细胞后，经RT-PCR检测发现，在HepG2细胞中EGFP基因转录水平明显大于L02和HeLa细胞，半定量分析为1.00∶0.54∶0.32（图2）。 3．TUNEL染色检测Adeno-asmdr转染HepG2R细胞凋亡：在未加药的HepG2R细胞，几乎难以见到凋亡细胞，而转染后的HepG2R细胞，在阿霉素作用下，存在大量凋亡细胞，在未经转染的HepG2R细胞，凋亡比例明显低于转染组（图3）。 4. Western blot检测转染Adeno-asmdr后不同时间P-gp170的表达：Adeno-asmdr转染HepG2R细胞后，P-gp170在转染后24h无明显降低，48h表达量则明显下降；至72h，进一步下降，但与48h相比，降低幅度并不明显；7d时可见呈较低水平表达，但与HepG2细胞比较，仍然高于诱导耐药前水平，表明细胞P-gp170蛋白虽有下降，但并未被完全阻断表达（图4）。 5． 流式细胞术检测不同药物作用下细胞周期和凋亡率的改变：流式细胞术检测发现未经任何处理的HepG2和HepG2R细胞的细胞周期分布、凋亡率并无明显差异，而Adeno-asmdr对HepG2R细胞的转染也未对细胞造成明显不良反应，细胞凋亡率无明显上升，与前面重组腺病毒对HepG2细胞生长曲线无明显改变的实验结果吻合。HepG2R细胞在转染前及转染后48h，分别以阿霉素、5-氟尿嘧啶和紫杉醇处理，加入相同剂量同一种药物后，与未经转染的HepG2R相比，Adeno-asmdr转染后的细胞出现明显的周期阻滞，大量细胞被阻滞于S期和G2/M期，G0/G1期细胞比例显著下降，凋亡率（sub-G1期细胞）明显升高，证实HepG2R细胞经Adeno-asmdr转染后，对3种化疗药物的耐受能力明显下降，其多药耐药表型被有效逆转（图5，6）。 讨 论 肿瘤细胞在化疗过程中产生的多药耐药往往是临床化疗失败的主要原因，其中一个重要原因是mdr1基因在化疗过程中的表达被诱导上调，导致其编码产物P-gp170蛋白在肿瘤细胞膜过度表达，同样现象也存在于肝细胞癌[7-8]。从基因转录或翻译水平着手是从根本上逆转肿瘤细胞多药耐药的关键[9]。我们运用反义技术，将mdr1编码区起始位点开始的200bp结构基因反向插入到重组腺病毒载体，利用腺病毒可自动感染细胞并在细胞内转录插入后目的基因的特性，在多药耐药表型的HepG2R细胞转录mdr1反义RNA，以期达到封闭mdr1的转录和表达。携带该271bp AFP启动子的重组腺病毒载体可在AFP阳性HepG2肝癌细胞中被有效转录，在极微量AFP表达的正常肝细胞L02中以及无AFP转录的HeLa细胞中，EGFP仅有极少量转录，充分体现了该腺病毒载体的靶向性，有望成为进行靶向性基因治疗的良好载体工具。 以EGFP基因作为报告基因，结合以往的报道[5]，初步证实了此腺病毒载体的具有一定的靶向性，进而将200bp mdr1序列反向插入至腺病毒中，构建Adeno-asmdr腺病毒载体，使其亦具备相似的靶向性特征。有报道显示该约300bp大小的启动子活性有限，不能很好地达到启动下游基因转录的作用[10]。许多研究将各种增强子序列插入该启动子上游以提高其转录活性[11]。我们保留了pshuttle原来的增强子，在一定程度上可能有助于提高启动子活性。实验结果也显示，在HepG2细胞中，EGFP基因可达到较高水平的转录和表达，重组腺病毒对HepG2细胞的转染效率也令人满意，证实该271 bp启动子顺序可良好地达到启动下游基因转录的作用[12]。 实验结果显示，以100pfu/ml的Adeno-asmdr1转染HepG2R细胞，其P-gp170在转染后48h表达明显下降，以后维持在较低水平，并至少持续7d以上。对阿霉素、5-氟尿嘧啶、紫杉醇等3种化疗药物的反应也呈现相似的趋势，即从转染后48h开始，对3种药物的敏感性得到极大的提高。流式细胞术对细胞周期和凋亡比例的分析也提示转染后细胞出现明显的S期和G2/M期阻滞，凋亡比例显著升高。 以上实验均证实了Adeno-asmdr1可在AFP阳性的HepG2R细胞中有效逆转其多药耐药表型，但并不能被完全逆转，原因可能为：（1）参与多药耐药的基因并不只有mdr1，多药耐药相关蛋白基因等同样具有重要作用[2]，单纯封闭了mdr1基因，并不能完全逆转MDR；（2）反义技术本身尚待深入研究，目前任何基因封闭技术都难以达到对目的基因的完全封闭[13]；（3）重组腺病毒滴度不足，本实验在测定了腺病毒滴度后，参考操作手册，以100pfu/ml的感染复数进行细胞转染，我们认为该滴度重组腺病毒对细胞的转染效率是满意的，并且细胞未出现明显细胞病变效应，因此未进一步摸索更合理的病毒滴度；（4）重组腺病毒中AFP启动子效率有限，在本实验中我们运用的AFP基因上游调控序列为转录位点上游约300bp片段，远远小于5.1kb的全长调控序列，可能与全长序列相比，其转录活性受到一定影响。 重组腺病毒Adeno-asmdr可特异地在AFP阳性的肝癌细胞内转录mdr1基因反义序列，以达到对HepG2R细胞mdr1基因转录和翻译的阻断作用，具有显著逆转HepG2R细胞多药耐药表型的作用。本实验从细胞水平证实了Adeno-asmdr对耐药的肝癌细胞多药耐药的逆转作用，体现出良好的AFP阳性细胞特异靶向性，为下一步动物体内实验和最终将本研究成果运用于临床实践打下了良好的基础。 参 考 文 献 [1] [2]Lee EJ, Jameson JL. 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