【关键词】癌，肝细胞； RNA干扰； STAT3 Effect of silencing STAT3 gene with siRNA on HepG2 and SMMC-7721 hepatocarcinoma cell lines GUO Jin-ying, WEN Yang-an, JIANG Xi-xin, LIU Jin-bo, ZHANG Yan-liang, TU Zhi-guang. 【Key words】Carcinoma, hepatocellular; RNA interference; STAT3 【First author’s address】 Clinical Laboratory, Heping Hospital of Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China Corresponding author: TU Zhi-guang, Email: tuzhiguang@yahoo.com.cn. Department of Laboratory, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016, China 肝细胞癌是常见的危害人类健康的恶性肿瘤之一，其发生、发展过程受诸多因素的影响。近年研究发现，信号转导和转录激活因子（STAT）具有强烈的抑制细胞凋亡，促进细胞增殖的作用，参与了人类恶性肿瘤的发生、发展和演变，其中以STAT3尤为活跃。本研究利用RNA干扰（RNAi）技术，用短发夹样RNA（shRNA）设计并构建RNAi-DNA质粒，筛选稳定表达小干扰RNA（siRNA）的肝癌HepG2及SMMC-7721细胞株，体外研究siRNA稳定和特异性诱导肝癌STAT3基因转录后沉默并逆转其恶性表型的能力，从而探索肝癌治疗的新方法。 一、材料与方法 1．材料：HepG2及SMMC-7721肝癌细胞株（为本实验室保存）在含10%胎牛血清的DMEM培养液37℃ 5% CO2孵箱中培养；质粒pGenesil-1购自武汉晶赛生物工程技术有限公司；限制性内切酶、RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；抗人STAT3多克隆抗体购自美国eBioscience公司；抗人GAPDH抗体购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司产品。转染试剂lipofectamine2000和Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。 2．shRNA发夹结构的设计、合成与重组质粒的构建：根据GenBank公布的STAT3 mRNA序列（NM 139276），应用Ambion公司的在线设计软件，并根据干扰序列的设计原则，在STAT3编码区选取AAGAATCACGCCTTCT ACAGA（464～484）；AAGAGTCAAGGAGACATGCAA（670～690）；AACATCTGCCTAGATCGGCTA（901～921）3段作为靶序列，针对3段靶序列相应设计3对DNA模板链（分别为STAT3-1，-2，-3），每条模板链的组成包括19个碱基正义链和其互补的反义链，正反义链之间被9bp的非同源序列（TTCAAGAGA）所间隔，反义链之后加入TTTTTT作为终止信号，模板链的两端分别加入HandⅢ及BamHⅠ酶切位点。同时设计一对非相关序列作为阴性对照。根据以上设计的序列合成如下引物，其中每对引物的3′端有9个碱基互补配对（划线部分）：Stat1F：5′-CGCGGATCCCG AATCACGCCTTCTACAGATTCAAGAGA-3′，Stat1R：5′-CCCAAGCTTTTCCAAAAAAGAATCACGCCTTC TACAGATCTCTTGAA-3′；Stat2F：5′-CGCGGATCCC GAGTCAAGGAGACATGCAATTCAAGAGA-3′，Stat2R：5′-CCCAAGCTTTTCCAAAAAAGAGTCAAG GAGACATGCAATCTCTTGAA-3′；Stat3F：5′-CGCG GATCCCGCATCTGCCTAGATCGGCTATTCAAGAGA-3′，Stat3R：5′-CCCAAGCTTTTCCAAAAAACATCT GCCTAGATCGGCTATCTCTTGAA-3′。每对引物分别以对方为模板，通过PCR的方式扩增出完整的DNA模板双链，然后与质粒pGenesil-1经HandⅢ和BamHⅠ限制性内切酶进行双酶切后连接，转化大肠杆菌，测序并鉴定。 3. 质粒转染：利用脂质体将重组质粒转染到生长状态良好的HepG2及SMMC-7721细胞，每株细胞均分为未转染组、空质粒对照、阴性质粒对照及重组质粒实验1、2、3组。分别于转染48h后进行G418抗性筛选，将阳性克隆细胞扩增。 4．RT-PCR：采用Trizol试剂提取各组细胞的总RNA，逆转录获取cDNA。参照基因库STAT3序列，设计STAT3编码基因的引物，进行PCR，同时以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参照。PCR产物电泳后在BioRad图像分析仪上成像,用Quantity one-4.6.2分析软件测得电泳图谱上每基因条带的吸光度（A）值。计算各个样本STAT3强度与甘油醛-3-磷酸脱氢酶强度的比值来反映STAT3表达的变化，并进行统计学分析。 5．Western blot分析：提取细胞总蛋白质，取50μg上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过电转移法将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移至聚偏氟二乙烯膜上，4℃封闭过夜，次晨加入兔抗人STAT3多克隆抗体（工作浓度为1∶500）37℃孵育2h，再加入和辣过氧化物酶结合的羊抗兔IgG（工作浓度为1∶600）37℃孵育2h，最后进行化学发光显色，成像并采用软件Quantity one-4.6.2进行分析。 6. 流式细胞术检测细胞生长周期：用胰蛋白酶将各组细胞消化并收集在离心管中，以预冷的磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次后，用磷酸盐缓冲液重悬细胞，体积分数为75%的乙醇固定，碘化丙啶染色，最后进行流式细胞仪检测。 7．统计学处理：应用方差分析进行t检验，用SAS8.2统计软件进行分析。 二、结果 1. STAT3 mRNA及蛋白的表达状况：通过软件分析显示，在空质粒对照、阴性质粒对照与未转染组间STAT3 mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）,而重组质粒实验2、3组均不同程度地在mRNA水平抑制了STAT3的表达，与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05），其抑制率在HepG2细胞分别为75.1%和65.0%，在SMMC-7721细胞为69.3%和62.5%。重组质粒实验1组与对照组相比，差异则无统计学意义（P>0.05）。Western blot检测结果显示上述两重组质粒分别在蛋白质水平抑制了STAT3的表达，与RT-PCR揭示的mRNA改变一致(图1)。 2．重组质粒转染对肝癌细胞HepG2、SMMC-7721生长周期的影响：流式细胞仪分析结果显示，重组质粒实验2、3组与空质粒对照组比较，均显示S期细胞明显减少，G0～G1期细胞明显增加,且在G0～G1期前出现凋亡峰，提示重组质粒抑制STAT3后，可诱导肝癌细胞周期停滞在G1期,抑制肝癌细胞的分裂增殖，促进细胞凋亡。 三、讨论 STAT3广泛存在于不同类型的细胞和组织中，在脑、肝、心、睾丸、胸腺等组织中均有表达[1]。有研究结果显示，STAT3异常激活与多种恶性肿瘤发生、发展及预后密切相关[2]。最近，STAT3作为癌基因在肿瘤的免疫逃避、血管新生和侵袭转移中的作用也日益受到人们重视，以STAT3为靶点进行的肿瘤治疗研究已成为肿瘤基因治疗的热点[3]。 RNAi技术与其他用于肿瘤基因治疗的方法相比，具有更高的特异性和更强的抑制目的基因表达的效果。因此，应用RNAi技术抑制相关基因的表达，可以起到抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用，达到治疗肿瘤的目的[4-6]。 siRNA的合成方法有多种，本研究应用siRNA表达载体体内转录的方法，通过PCR的方式扩增获得完整的能编码siRNA的DNA模板链，与pGeneSil 1.0表达载体酶切后连接，建立含与目的基因mRNA互补的载体，转染肝癌细胞（HepG2及SMMC-7721），在U6转录启动子的作用下，在细胞内转录得到siRNA。该方法的优点是通过PCR而直接获得双链DNA模板，进一步减少了因人工合成单链DNA模板的费用，与载体连接后使siRNA直接在体内得到稳定表达,是用于RNAi研究的较好方法。 本研究结果显示，重组质粒实验2、3组均有效地抑制了STAT3基因的表达。流式细胞仪检测细胞周期结果发现转染干扰质粒的细胞增殖明显受到抑制，使细胞生长周期停止在G1期,并可促进细胞凋亡。另外，本研究应用RNAi技术同时对肝癌细胞的两大代表株（HepG2及SMMC-7721）进行了研究，所获结果一致，从而验证了该项研究的可靠性，并再次证明了STAT3基因在肝细胞癌中扮演着重要的角色，提示通过RNAi技术沉默基因STAT3的表达，可改变肿瘤细胞的恶性行为，有望成为未来人类治疗肝癌的有效策略之一。 参 考 文 献 [1]Buettner R, Mora LB, Jove R. Activated STAT signaling in human tumors provides novel molecular targets for therapeutic intervention. Clin Cancer Res, 2002, 8: 945-954. [2]Trovato M, Vitarelli E, Grosso M, et al.Immunohistochemical expression of HGF, c-MET and transcription factor STAT3 in colorectal tumors. Eur J Histochem, 2004, 48: 291-297. [3]Jing N, Tweardy DJ.Targeting Stat3 in cancer therapy. Anticancer Drugs, 2005, 16: 601-607. [4]Butz K, Ristriani T, Hengstermann A, et al. siRNA targeting of the viral E6 oncogene efficiently kills human papillomavirus-positive cancer cells. Oncogene, 2003, 22: 5938-5945. [5]Chen Y, Stamatoyannopoulos G, Song CZ. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res, 2003, 63: 4801-4804. [6]Grzmil M, Thelen P, Hemmerlein B, et al. Bax inhibitor-1 is overexpressed in prostate cancer and its specific down-regulation by RNA interference leads to cell death in human prostate carcinoma cells. Am J Pathol, 2003, 163: 543-552. 中华肝脏病杂志版权 |