【关键词】卵圆细胞； 免疫组织化学； 基质细胞衍生因子-1； CXCR4 Expressions of stromal cell-derived factor-1 and of its receptor CXCR4 in rat proliferating hepatic oval cells HUANG Xiao-ming, JIAO Xing-yuan, ZENG San-ping, DU Jun, HU Yi-ze, LUO Can-qiao. 【Key words】Oval cells; Immunohistochemistry; Stromal cell-derived factor-1; CXCR4 【First author’s address】 Department of General Surgery, Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510260, China Corresponding author: JIAO Xing-yuan, Email: jiaoxingyuan@ hotmail.com 近年来，有研究表明基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1,SDF-1）和其受体CXCR4（SDF-1/CXCR4）轴在干细胞的增殖分化中起至关重要的作用[1]。本研究采用2-乙酰氨基芴联合部分肝脏切除术（AAF/PH）成功诱导肝卵圆细胞增殖，同时给AAF/PH模型大鼠注射CXCR4特异性抑制剂AMD3100，通过检测SDF-1和其受体CXCR4在卵圆细胞增殖过程中表达的变化情况，进一步研究SDF-1/CXCR4轴在肝卵圆细胞增殖过程中的作用。 一、材料与方法 1. 实验动物及分组: 雄性Wistar大鼠144只，体质量180～200g，购自中山大学医学院动物实验中心，随机分为PH组、AAF/PH组、AMD3100/PH组和AAF/AMD3100/PH组共4组，每组36只。 2. 动物模型的建立: 动物购来后，普通饲养1周， AAF/PH组大鼠通过胃管灌喂AAF（购自美国Sigma公司），同时通过尾静脉注射等渗盐水， 1次/d，连续4d；第5天在2%戊巴比妥腹腔注射麻醉（0.1mg/100g）下行2/3肝切除术，手术当日不灌喂、不注射等渗盐水；第6天继续灌喂并注射。AMD3100/PH组大鼠通过胃管灌喂等渗盐水，同时通过尾静脉注射AMD3100（购自美国Sigma公司），余同AAF/PH组。AAF/AMD3100/PH组大鼠通过胃管灌喂AAF，同时经尾静脉注射AMD3100，余同AAF/PH组。PH组大鼠通过胃管灌喂等渗盐水，同时通过尾静脉注射等渗盐水，余同AAF/PH组。AAF溶于相对分子质量为400的聚乙二醇（购自美国Sigma公司），给予剂量均为15mg/kg，AMD3100溶于磷酸盐缓冲液，给予剂量均为1.25mg/kg。各组灌喂等渗盐水的量与灌喂的AAF溶液量相同，经尾静脉注射等渗盐水的量与注射的AMD3100量相同。各组分别于手术后第3、5、7、10、14、21天处死大鼠（每组6只），取大鼠肝组织，用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，以备HE染色及免疫组织化学染色用。 3. 组织学检查：石蜡切片经脱蜡水化后，用苏木素-伊红（HE）染色，显微镜下观察肝组织结构变化、卵圆细胞的形态及计数其数量。 4．免疫组织化学染色：用SP法，以磷酸盐缓冲液代替第一抗体作为阴性对照。小鼠抗大鼠细胞角蛋白CK18、CK19抗体均购自美国Sigma公司，小鼠抗大鼠甲胎蛋白（AFP）抗体购自英国Biogenesis公司。小鼠抗大鼠SDF-1抗体购自中国博士德生物工程有限公司，小鼠抗大鼠CXCR4抗体购自中国香港先进技术工业有限公司。 5．判断标准：阳性细胞为胞质和（或）胞膜棕褐色染色。在400倍镜下，随机选取10个视野并计算出平均阳性细胞数，与1.6相乘后所得为细胞数/mm2[2]。 6. 大鼠肝卵圆细胞增殖的定量比较[3]：各时点标本分别选取10个互不重叠且肝卵圆细胞增殖最明显的视野，在400倍显微镜下对符合肝卵圆细胞特征且CK19染色呈阳性的细胞进行计数，取其平均数值作为该标本肝卵圆细胞增殖数量。同样计数SDF-1及CXCR4阳性细胞数。 7. 统计学分析：数据处理用SPSS11.0软件，所有数据用x-±s表示，多组资料均数比较用方差分析，两组资料之间的比较用t检验。 二、结果 1. 肝组织学检查：AAF/PH组大鼠术后第14天可见少数胆管增生，术后第21天见明显的胆管增生。AAF/AMD3100/PH组大鼠术后第14天肝组织内血管明显扩张，肝细胞核增大，肝窦及门管区有较多淋巴细胞浸润，术后第21天肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，部分肝细胞呈大片状坏死。AMD3100/PH组和PH组大鼠肝组织结构正常。 2. 卵圆细胞增殖情况：AAF/PH组大鼠肝组织内均见有肝卵圆细胞增殖，增殖高峰期为术后第10～14天，术后第21天开始减少。AAF/AMD3100/PH组大鼠肝卵圆细胞的数量在术后第3天与AAF/PH组差异无统计学意义，术后第5、7、10、14、21天与AAF/PH组差异均有统计学意义，尤以术后第14天最为明显（27.50±2.92对1.60±1.17，t＝26.06，P<0.01），且随着注射AMD3100时间的延长，卵圆细胞的数量逐日减少（表1）。增殖的肝卵圆细胞大多以门管区为中心，沿着肝窦呈簇状或放射状分布，卵圆细胞呈圆形或卵圆形，胞质较少，胞核较小，比肝细胞核约小1/3。AMD3100/PH组和PH组大鼠肝组织内均未见卵圆细胞。 3. 免疫组织化学染色结果：AAF/PH组大鼠术后第3、5、7、10、14、21天肝卵圆细胞胞质CK18、CK19、甲胎蛋白、SDF-1及其受体CXCR4染色均呈阳性；术后第14天SDF-1阳性细胞沿着汇管区胆管上皮生长，小叶内肝细胞呈现迟发性SDF-1阳性表达，CXCR4阳性细胞沿胆管样细胞成簇状分布；术后第21天卵圆细胞向胆管样细胞分化。AAF/AMD3100/PH组大鼠术后第3天卵圆细胞胞质SDF-1及其受体CXCR4染色阳性，且随着注射AMD3100时间的延长，SDF-1及CXCR4阳性细胞的数量明显减少（P<0.01），见表2。AMD3100/PH组和PH组大鼠肝脏组织内均未见SDF-1及CXCR4阳性表达。 三、讨论 本研究中，为确定CXCR4是否对卵圆细胞的积聚起一定作用，我们对AAF/PH模型大鼠尾静脉注射能和CXCR4结合并阻碍其生物学活性的特异性抑制剂AMD3100，结果显示，注射AMD3100后大鼠肝组织中卵圆细胞的数量较AAF/PH组明显减少，而且在术后第14天见AAF/AMD3100/PH模型组大鼠肝组织内血管明显扩张，肝窦及门管区淋巴细胞浸润等现象，术后第21天出现肝索排列紊乱，肝小叶结构破坏，部分肝细胞呈大片状坏死等严重肝损害现象，从而表明CXCR4可能有促进大鼠肝卵圆细胞增殖的作用。 SDF-1是一种趋化因子，是干细胞运输的主要调节器[4]。许多器官的基质细胞和内皮细胞分泌SDF-1,如心脏、骨骼肌、肝脏、脑和肾脏等，当组织受损时，如心肌梗死、肢体局部缺血、肝脏毒性损害、过量失血等，SDF-1的分泌作用就会增强[5]。Mavier等[6]用AAF/PH模型成功地诱导肝卵圆细胞增殖，并检测到卵圆细胞表达SDF-1及其受体CXCR4；通过给AAF/PH模型大鼠腹腔注射一种能和SDF-1结合并阻碍其生物学活性的药物墨角藻聚糖后，结果显示大鼠肝卵圆细胞增殖的数量较AAF/PH模型大鼠明显减少，从而得出SDF-1可能通过自分泌/旁分泌途径刺激肝卵圆细胞增殖的结论。本实验免疫组织化学染色显示，肝卵圆细胞在增殖过程中表达SDF-1及其受体CXCR4，通过给AAF/PH模型大鼠尾静脉注射CXCR4的特异性抑制剂AMD3100后，结果显示随着注射AMD3100时间的延长，卵圆细胞的数量逐渐减少。在AAF/PH模型中，2/3肝叶切除给肝脏制造严重损伤，为肝干细胞-卵圆细胞的增殖发出信号，同时AAF抑制残存的肝细胞增殖，这时CXCR4沿着SDF-1梯度向肝脏迁移并与SDF-1结合，通过激活磷脂酰肌醇-3（PI3）、丝裂原结合蛋白激酶和核因子-κB,刺激卵圆细胞增殖以完成肝脏的再生。本实验中，通过给AAF/PH模型大鼠尾静脉注射CXCR4的特异性抑制剂AMD3100,其与CXCR4紧密结合，从而阻断了SDF-1与CXCR4结合，SDF-1/CXCR4轴的生物学作用被阻断，卵圆细胞的增殖受阻。因此，我们推测卵圆细胞的增殖可能是SDF-1/CXCR4轴作用的结果。 本研究表明，趋化因子SDF-1及其受体CXCR4可能是肝卵圆细胞的重要标记物，同时SDF-1/CXCR4生物学轴可能有刺激肝干细胞活化、促进肝卵圆细胞增殖的作用，但其具体作用机制还有待进一步研究。 参 考 文 献 [1]Huang XM, Jiao XY, Hu YZ. Progress on the source,differentiation and proliferation of hepatic oval cell. Guoji Waikexue Zazhi, 2007,34: 553-555. (in Chinese) 黄晓明，焦兴元，胡以则.肝卵圆细胞来源分化增殖的研究进展.国际外科学杂志,2007,34:553-555. [2]Chen GD, Liu YL. Roles of IP-10 and MIP-3α in rat allografted liver. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 58-59. (in Chinese) 陈国栋,刘玉兰.趋化因子IP-10和MIP-3α在大鼠同种异体肝移植免疫中的作用.中华肝脏病杂志，2005,13:58-59. [3]Chen YK, Wang YM, Li JG, et al. Establishment and optimization of rat models for hepatic oval cells proliferation. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2002, 10: 185-188. (in Chinese) 陈耀凯，王宇明，李俊刚，等.大鼠肝卵圆细胞增殖模型的建立与优化.中华肝脏病杂志，2002,10:185-188. [4]Schier AF. Chemokine signaling: rules of attraction. Curr Biol, 2003, 13: R192-194. [5]Kucia M, Reca R, Miekus K, et al. Trafficking of normal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve similar mechanisms: pivotal role of the SDF-1-CXCR4 axis. Stem Cells, 2005, 23: 879-894. [6]Mavier P, Martin N, Couchie D, et al. Expression of stromal cell-derived factor-1 and of its receptor CXCR4 in liver regeneration from oval cells in rat. Am J Pathol, 2004, 165: 1969-1977. 中华肝脏病杂志版权 |