【关键词】血红素氧合酶； 一氧化碳； 肝； 缺血再灌注损伤； 氧化性应激 Protective effect of heme oxygenase on hepatic ischemia reperfusion injury in rats FENG Zhi-jie, CHEN Xiang-ping. 【Key words】Heme oxygenase; Carbon monoxide; Liver; Ischemia-reperfusion injury; Oxidative stress 【First author’s address】 Department of Gastroenterology, Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China Email: zhijiefeng2005@ 163.com 血红素氧合酶（HO）是血红素降解的起始酶和限速酶，能在体内分解血红素生成一氧化碳（CO）、胆绿素和游离铁。研究发现，HO对缺血再灌注损伤器官组织起保护作用[1]。本研究旨在通过应用血红素氧合酶的诱导剂氯高铁血红素和抑制剂锌原卟啉（ZnPP）来研究HO对大鼠肝脏缺血再灌注（IR）损伤的影响及其可能机制。 一、材料与方法 1. 试剂：试剂氯高铁血红素和ZnPP购自美国Sigma公司，兔抗大鼠HO-1多克隆抗体购自武汉博士德生物工程公司，兔抗大鼠p38 MAPK多克隆抗体、大鼠SP试剂盒购自北京中山生物技术公司。 2. 肝脏IR损伤模型制备： 雄性Wistar大鼠，体重（258±39）g，由河北医科大学实验动物中心提供。以10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔内注射麻醉大鼠，取腹部正中切口入腹，显露肝脏，分离供应肝左叶和中叶的肝动脉和门静脉，用显微血管夹夹住，造成肝脏缺血，钳夹45min后，取出血管夹，然后缝合关腹。 3. 实验分组：80只大鼠随机分为4组：（1）假手术组（n＝8）：麻醉后行腹正中切口，然后关腹。（2）IR组（n＝24）：麻醉后行IR，不加干预。（3）氯高铁血红素（hemin）组（n＝24）：于IR前12h，腹腔内注射氯高铁血红素，20mg/kg。（4）ZnPP组（n＝24）：于IR前3h和16h，分2次腹腔内注射ZnPP,各10μmol/kg。IR组、氯高铁血红素组和ZnPP组分别于再灌注0、4、8、12h 4个时间点各取6只大鼠采集静脉血和处死后留取肝左叶组织待检。 4. 实验方法：（1）肝功能测定: 血浆ALT、AST采用生化自动分析仪测定。（2）超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）测定：用匀浆机研磨成10%的肝组织匀浆，以3000r/min离心，取上清液采用黄嘌呤氧化法测定SOD活性，用硫代巴比妥酸法测定MDA含量。（3）肝脏病理学观察：肝组织HE染色，用显微镜观察。（4）HO-1、p38 MAPK蛋白表达：采用免疫组织化学染色法。组织脱蜡至水，3%过氧化氢孵育，抗原热修复，滴加第一抗体（HO-1兔多克隆抗体以1∶100稀释，p38 MAPK兔多克隆抗体以1∶50稀释），4℃过夜，滴加1∶100稀释的生物素标记的第二抗体，滴加1∶100稀释的辣根酶标记的第三抗体，DAB显色，复染后封片，以细胞浆内呈现黄褐色颗粒为阳性细胞，通过图像采集分析系统对每随机采集的4个阳性表达视野进行综合分析，得出1个积分光度值，每组采集6个积分光度值后，进行统计分析。 5. 统计学分析：数据用均数±标准差表示。用SPSS 10.0软件进行统计分析，采用q检验或秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 二、结果 1. 肝脏病理学表现：大体观察，在假手术组，肝脏呈红褐色，表面光滑，质地柔软，经夹闭血管造成缺血大约5min后，肝左叶和中叶呈灰白色。当松开血管夹后，瞬间肝脏左叶和中叶呈深红色，随着再灌注时间延长，颜色由深红色逐渐接近红褐色。 组织学观察，在假手术组肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞形态基本正常。在肝脏钳夹缺血后45min（即再灌注0h），在IR组中央静脉收缩，肝细胞肿胀，肝窦变窄。随着时间延长肝细胞肿胀加重，脂肪变性，炎性细胞浸润，肝组织片状、大片状坏死灶；在hemin组于相应时间点肝细胞肿胀、脂肪变性和细胞坏死减轻，而在ZnPP组，肝细胞肿胀、脂肪变性加重，可见大片状坏死灶。 2. 血浆ALT、AST测定：与假手术组相比，IR组于再灌注0、4、8、12h各时间点，ALT、AST均有增高（P< 0.05）。与IR组相比，在hemin组，于再灌注4、8、12h时ALT均有降低（q值分别为4.70，6.50，5.13，P值均<0.05），于再灌注4、12h时AST减低（q值分别为5.02，6.39，P值均<0.05）；而在ZnPP组，于再灌注8、12h时ALT增高（q值分别为6.73，5.08，P值均<0.05），再灌注4、8h时AST增高（q值分别为6.30，8.20，P值均<0.05），见表1。 3. 肝组织SOD、MDA测定：与假手术组相比，在IR组于再灌注0、4、8、12h各时间点，SOD活性均有降低，MDA含量均见增高（P<0.05～P<0.01）。与IR组比较，在hemin组于再灌注4、8、12h时SOD活性增高（q值分别为4.39，3.72，3.89，P值均<0.05），MDA含量降低（q值分别为3.13，3.65，4.59，P值均<0.05）；ZnPP组SOD活性降低（q值分别为4.17，3.78，3.72，P值均<0.05），MDA含量增高（q值分别为3.70，3.29，4.12，P值均<0.05），见表1。 4 HO-1蛋白表达：HO-1在假手术组肝脏表达为阴性。在IR组于0、4h时表达为阴性，于8、12h时在中央静脉和汇管区周围的肝细胞胞浆有阳性表达。在hemin组，于再灌注4、8、12h时有阳性表达，且较IR组相同时间点增加（t值分别为2.45，2.65，3.19，P值均<0.05）。ZnPP组在再灌注0、4h时未见HO-1阳性表达，在8、12h时可见阳性表达，但较相同时间点的IR组表达减少（t值分别为2.15、2.78，P值均<0.05）。 5. p38 MAPK蛋白表达：在假手术组中，肝窦内皮细胞胞浆中呈阳性表达。在IR组、hemin组和ZnPP组再灌注0、4、8、12h各时间点均可见阳性表达，但与IR组比较，在hemin组、ZnPP组的p38 MAPK蛋白表达未见明显差异。 三、讨论 氧化应激是肝脏IR损伤的重要原因，MDA作为脂质过氧化的产物，常被用作评价细胞脂质过氧化损害的标志，在缺血再灌注时明显升高[2]。SOD作为一种抗氧化物质，能把超氧化物转变为过氧化氢，然后被过氧化物酶去除，在IR损伤中能够减轻氧自由基的损伤[3]。本实验中，在IR组各时间点的ALT、AST增加。在hemin组，再灌注0h时SOD活力较IR组降低，在再灌注4、12h时ALT、MDA降低，而SOD活力升高。而在ZnPP组，再灌注4、8、12h时AST、MDA水平升高，而SOD活力降低。在hemin组肝细胞水肿、脂肪变性、坏死等表现较IR组减轻，而ZnPP组则较IR组加重，表明HO对肝脏IR损伤有保护作用，其作用可能与抑制脂质过氧化有关。 当应激状态时，HO可在肝实质细胞和间质细胞表达。Kato等[4]分别用CoPP（HO-1诱导剂）和ZnPP对肝脏进行预处理，可见HO-1能使肝脏耐受更长时间的冷藏。Lanteri等[5]发现应用L-精氨酸可增加IR大鼠肝脏HO-1的表达，预防再灌注后的氧化损伤。本实验中，正常肝脏组织未见HO-1表达，在IR后8h，肝脏中央静脉和汇管区周围的肝细胞可见HO-1表达。在hemin组，肝脏HO-1表达增多，而在ZnPP组HO-1表达减少。 本实验中，在IR组、hemin组和ZnPP组各组p38 MAPK表达无明显差别，并不能表明HO-1是通过p38 MAPK通路而对肝脏IR损伤发挥作用的。 参 考 文 献 [1]Lai IR, Chang KJ, Chen CF, et al. Transient limb ischemia induces remote preconditioning in liver among rats: the protective role of heme oxygenase-1. Transplantation, 2006, 81: 1311-1317. [2]Bedirli A, Sakrak O, Muhtaroglu S, et al. Ergothioneine pretreatment protects the liver from ischemia-reperfusion injury caused by increasing hepatic heat shock protein 70. J Surg Res, 2004, 122: 96-102. [3]Yuzawa H, Fujioka H, Mizoe A, et al. Inhibitory effects of safe and novel SOD derivatives, galactosylated-SOD, on hepatic warm ischemia/reperfusion injury in pigs. Hepatogastroenterology, 2005, 52: 839-843. [4]Kato H, Amersi F, Buelow R, et al. Heme oxygenase-1 overexpression protects rat livers from ischemia/reperfusion injury with extended cold preservation. Am J Transplant, 2001, 1: 121-128. [5]Lanteri R, Acquaviva R, Di Giacomo C, et al. Heme oxygenase 1 expression in postischemic reperfusion liver damage: effect of L-arginine. Microsurgery, 2006, 26: 25-32. 中华肝脏病杂志版权 |