【摘要】目的 探讨幽门螺杆菌（H. pylori）经口接种长期感染后，是否可到达肝脏并作为独立的致病因素导致小鼠肝脏病变，甚至肝癌的发生。 方法 H. pylori悉尼株（SS1）经口接种C57BL/6小鼠，24个月时处死。检测小鼠胃、肝组织内细菌定植情况与病理改变；提取肝组织内细菌DNA，巢式PCR扩增小鼠肝组织H. pylori 16S rRNA基因，PCR产物测序，并与胃黏膜分离的H. pylori、接种H. pylori SS1的16S rRNA PCR产物测序结果进行同源性比较。 结果 接种组12只小鼠在胃黏膜检测到H. pylori，11只出现胃组织病理改变，其中1只发生胃淋巴瘤。接种组7只在肝脏检测到H. pylori，6只出现肝脏病理变化，其中1只轻微炎症；3只炎症伴纤维化病变；2只炎症伴纤维化及异型性增生。接种组肝脏H. pylori染色阳性且出现肝脏病理改变小鼠，胃H. pylori染色均呈阳性。接种组肝脏H. pylori染色阴性小鼠和（或）胃H. pylori染色阴性小鼠，以及正常对照组小鼠均未发现肝脏病理改变。肝组织中扩增的H. pylori 16S rRNA PCR产物测序结果经序列分析后显示：与胃黏膜分离培养细菌、接种细菌同源性为100%。 结论 经口接种H. pylori 2年长期感染后，除导致小鼠胃组织病变外，部分小鼠胃组织感染细菌可到达肝脏，引起肝脏炎症，甚至肝硬化、癌前病变的发生。 【关键词】螺杆菌，幽门； 肝疾病； 小鼠 A two-year animal experimental study on the pathological effects of Helicobacter pylori on liver tissues TIAN Xue-fei, FAN Xue-gong, HUANG Xun, FU Chun-yan, DAI Hong, HUANG Yan. Department of Infectious Diseases, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China Corresponding author: FAN Xue-gong, Email: xgfan@ hotmail.com 【Abstract】Objective To observe whether H. pylori administered orally in mice could arrive in their livers after a long-term infection, leading to active inflammation and even causing HCC as an independent etiological factor. Methods Twenty C57BL/6 mice were orally administered H. pylori SS1 and kept for 24 months (experimental group) along with 13 mice which served as blank controls (control group). H. pylori colonization and pathologic consequences were studied in the livers and gastric tissues of the mice. The bacterial DNA extracted from liver tissues was examined by nested PCR for H. pylori 16S rRNA genes. 16S rRNA PCR amplicons were sequenced and compared with sequencing results of 16S rRNA PCR amplicons of the bacteria cultured from gastric mucosa and compared with that of the inoculated H. pylori SS1. Results Of the 20 mice in the experimental group, H. pylori was found in the gastric mucosa of 12, and in 11 of them pathological gastric lesions were found, including one with gastric lymphoma. H. pylori were found in the livers of 7 mice. Liver lesions, one with mild inflammation, 3 with inflammation and fibrosis, 2 with inflammation, fibrosis and hepatocytehyperplasia with atypia were found in 6 of them. No liver lesions were found in the mice of the control group. In the mice of the experimental group no liver lesions were found in those mice with no H. pylori in their gastric mucosae. Sequencing results of 16S rRNA PCR products of the liver showed 100% homogeneity with the cultured H. pylori from gastric mucosa and the administered H. pylori SS1. Conclusion Two years after oral administration of H. pylori to C57BL/6 mice, gastric mucosal lesions and liver lesions, including inflammation, cirrhosis and hepatocyte hyperplasia with atypia were found in those animals. 【Key words】Helicobacter pylori; Liver diseases; Mice 除乙型与丙型肝炎病毒、血吸虫感染及黄曲霉素的摄入等可导致肝癌外，仍有部分肝癌的发病原因不明。我们前期采用PCR方法在人肝癌患者肝组织内检测到幽门螺杆菌（H. pylori）16S rRNA基因[1, 2]，推测H. pylori可能为肝癌的潜在致病因素。为此，我们进行了H. pylori感染的动物实验，经口接种C57BL/6小鼠8个月时在肝脏内检测到接种的H. pylori及以淋巴细胞浸润为主的炎症改变，但未检测到肝脏的癌变或癌前病变[3]。考虑到H. pylori感染致癌是一个长期慢性的过程，我们进行了更为长程的2年动物实验观察，现报道如下。 材料与方法 1. 实验动物与菌株：C57BL/6小鼠（清洁级）33只，6～8周龄，雄性，体质量25～30g。购自上海实验动物中心，随机分为接种组（经口接种感染H. pylori，20只）与对照组（未接种H. pylori，13只）。接种细菌为H. pylori悉尼株（SS1），本室保存，H. pylori培养按文献[2]方法进行。 2. 主要试剂：蛋白酶K购自美国AMRESCO公司；Taq DNA聚合酶购自日本TaKaRa公司；dNTP、DNA 相对分子质量标准等购自大连宝生物公司。小鼠抗H. pylori单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；第二抗体为生物素标记的羊抗小鼠IgG，二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒均购自武汉博士德公司。 3. H. pylori感染动物模型的制备及处理：参照已建立的方法制备[4]。2个月时各组随机抽取3只小鼠处死，以确认感染组H. pylori成功定植和未感染对照组H. pylori为阴性。其余小鼠24个月时处死。取1/2肝组织4.0%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，其余1/2剪碎后TE液（Tris-EDTA缓冲液，50mmol/L Tris-HCl、pH7.5，1mmol/L EDTA）匀浆，置-20℃保存待提取细菌DNA。处死动物取全胃，沿胃大弯剪开，等渗盐水漂洗去除胃内容物；取少许胃黏膜涂培养平板；1/2胃组织4.0%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，其余1/2胃组织-20℃保存用于细菌DNA提取。病理切片用于HE染色、免疫组织化学染色及石碳酸-碱性品红H. pylori染色[4]。实验过程中死亡小鼠均及时取肝脏、胃组织标本4.0%甲醛溶液固定待测。 4.细菌DNA提取、PCR扩增及测序：参照文献[5]的方法培养细菌，并提取胃、肝组织细菌DNA。肝组织H. pylori基因检测采用巢式PCR方法：取外引物扩增产物1μl作为反应模板，再用内引物进行PCR反应，胃黏膜培养细菌及原始灌胃细菌直接采用内引物进行PCR反应,反应条件见表1。阴性对照细菌为空肠弯曲菌Lior4887519，购自中国预防医学科学院流行病学微生物研究所，阴性对照用双蒸水代替模板进行PCR反应。H. pylori 16S rRNA 基因内、外引物根据GenBank中H. pylori DNA序列进行设计。引物由上海生工生物工程公司合成，引物设计采用Primer primier 5.0软件。 5. 统计学分析：样本率的比较用χ2检验，P < 0.05为差异有统计学意义。 结 果 1. 解剖学观察及标本收集情况：C57BL/6小鼠经口灌胃接种感染H. pylori造模，2个月时观察H. pylori胃内定植情况，接种组与正常对照组各处死3只小鼠；接种组在实验过程中死亡7只，正常对照组无死亡。两组小鼠24个月时处死。接种组存活小鼠中1只小鼠腹部有巨大肿块（图1A），解剖后发现为胃部肿瘤（图1B）；1只小鼠肝脏出现囊肿（图1C）；2只出现椭圆形结节（图1D）。24个月实验结束时，接种组17只小鼠共收集肝、胃组织标本各14份（包括4只死亡小鼠肝、胃组织样本，3只因死亡时间过久未采集组织样本）；正常对照组收集肝、胃组织样本各10份。 2. 肝、胃组织细菌学检测：接种组10只存活小鼠24个月时处死，取胃黏膜进行涂板细菌培养，其中4只胃黏膜分离培养出H. pylori，在培养平板上可见清晰的针尖样菌落，革兰染色阴性，尿素酶试纸检测呈强阳性。在所有收集的接种组14份肝、胃组织样本中，12份在胃黏膜观察到H. pylori（85.7%，图2A）；7只小鼠在肝组织观察到H. pylori（50%），H. pylori在肝组织分布于肝小叶中央静脉及肝血窦内（图2B，2C）。免疫组织化学检测结果显示细菌呈棕黄色着色，主要位于肝窦内，亦有些位于汇管区内，细菌形态显示为同一类细菌，而不是杂菌（图2D）。 3. H. pylori 16S rRNA基因检测及测序：对24个月时存活小鼠的胃黏膜培养以分离细菌，或从肝、胃组织样本中提取细菌DNA，用巢式PCR方法检测H. pylori 16S rRNA基因。接种组10只存活小鼠，4只从胃组织分离培养的H. pylori菌株，其DNA全部扩增出16S rRNA基因，另6只从胃组织提取的细菌DNA中5只扩增出16S rRNA基因。巢式PCR检测接种组存活小鼠肝组织提取的细菌DNA，结果10只中有5只16S rRNA为阳性，阳性率50%；巢式PCR外引物PCR反应产物凝胶电泳后不能观察到明显条带或呈现多条杂带，而经过内引物扩增后，阳性的PCR产物条带清晰，而且没有非特异性产物条带出现。正常对照组H. pylori检测阴性。对小鼠肝组织样本的16S rRNA PCR产物测序，与胃黏膜分离培养以及接种H. pylori进行同源性比较，序列分析结果显示三者的同源性为100%。 4. 病理观察：接种组14份小鼠胃组织样本中（包括4份死亡小鼠样本），12份H. pylori染色阳性，有11份出现胃组织病理改变，其中8份胃黏膜出现以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润（图3B），2份观察到溃疡（图3C），1份出现胃组织肿瘤（存活小鼠），病理检查确定为胃淋巴瘤（图3D）。 在12只胃H. pylori染色阳性小鼠中，7只肝组织H. pylori染色阳性（2份为死亡小鼠样本），5只阴性。在7份阳性样本中6份观察到肝脏病理变化，均出现炎症改变。其中1份仅出现轻微炎症改变（死亡小鼠，图4B），3份伴随出现纤维化病变（1份来自死亡小鼠，图4C），2份除炎症、纤维化病变外，还观察到细胞及结构异型性增生（图4E，4F）。炎症改变特点以中央静脉、肝血窦以及门管区的小叶间动、静脉为中心，出现以淋巴细胞为主，夹杂少量中性粒细胞的弥漫性浸润（图4B）。纤维化改变包绕炎症区域而出现不典型增生结节，炎性细胞浸润与纤维化增生共同破坏了肝小叶正常结构（图4D，4E，4F）。5份肝组织H. pylori染色阴性，2份胃组织H. pylori染色阴性的接种组小鼠及正常对照组小鼠均未观察到肝脏病理变化（图4A）。 接种组出现肝脏病理改变的小鼠数与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；接种组中肝脏H. pylori染色阳性小鼠出现肝脏病理改变的数量与阴性小鼠比较，差异有统计学意义（P<0.01）。接种组胃组织H. pylori染色阳性的12只小鼠中，肝脏出现病理改变与肝脏未出现病理改变的小鼠胃组织病理改变无明显差异；观察到胃淋巴瘤的小鼠肝脏仅观察到少量炎症病变。见表2。 讨 论 H. pylori作为Ⅰ类致癌因子可引起胃淋巴瘤及胃癌已被认同，部分研究者一直在积极探索H. pylori是否与胃外疾病存在密切联系。已有研究证实，肝癌患者肝脏内有H. pylori感染[6]，我们也在肝癌患者肝组织内观察到螺杆状细菌[2]，采用激光显微切割技术将观察到的细菌捕获后提取DNA，扩增16S rRNA基因，并经测序分析发现该细菌与H. pylori有99%以上的同源性[7]。前期经口感染H. pylori 8个月的动物实验也证实了H. pylori可到达肝脏，并可引起肝脏类似于胃炎症改变的淋巴细胞浸润[3]。曾有学者观察到1只经口接种感染H. pylori C57BL/6的小鼠发生肝癌[8]。为进一步探讨及验证H. pylori是否导致肝癌的发生，我们进行了更为长程的动物实验，观察经口接种感染H. pylori的C57BL/6小鼠饲养24个月时肝脏的病理改变。 在接种H. pylori的C57BL/6小鼠24个月时肝脏出现比前期研究更为严重的炎症反应，这种炎症浸润具有螺杆菌感染特征，既引起以大量淋巴细胞为主间夹少量中性粒细胞的炎症浸润[9]。尤其淋巴滤泡的出现，与H. pylori引起胃黏膜病理改变具有高度相似性。增多的淋巴细胞以B淋巴细胞为主，这与H. pylori感染后T淋巴细胞活化引起B淋巴细胞增殖有关。这种炎症反应初期以单个汇管区中央小静脉为中心，至后期则扩展至多个汇管区，并在淋巴细胞浸润区外围出现纤维化包绕分割肝小叶，进一步形成纤维化包绕的不典型增生性结节。这种不典型增生性结节属于癌前病变的范畴，根据内含多个汇管区，无细胞、结构异型性的特征可确定为低度不典型增生性结节。更有意义的是，在1只小鼠肝脏组织内观察小细胞异型性增生及假腺样结构异型，这种病理改变高度提示癌变的可能。 从经口接种感染H. pylori的C57BL/6小鼠肝组织中扩增出H. pylori基因，其与胃组织培养的H. pylori以及接种的原始菌株同源性达100%，并在7只接种组小鼠肝组织内观察到弯曲杆状或S状细菌，证实了引起致病的H. pylori来自于经口接种的细菌。我们前期从消化性溃疡患者的外周血中检测出H. pylori 16S rRNA基因，测序后与胃内分离培养的H. pylori 16S rRNA基因有98%～99%同源性[10]，提示血源播散可能是H. pylori到达肝脏的重要途径之一。本研究中观察到H. pylori及其所导致的炎症浸润主要分布在血管周围，包括了中央静脉、肝血窦以及门管区的小动静脉。这种局部沿血管分布的炎性浸润与其他肝脏疾病的炎性浸润有着明显的区别，结合前期的研究结果，认为H. pylori通过损伤的胃黏膜入血，可能是H. pylori到达肝脏的重要途径。发生巨大胃淋巴瘤的小鼠，其肝脏病理改变仅有轻度的炎症改变，而且出现肝脏病理改变的小鼠与未出现肝脏病理改变的小鼠其胃组织病变并无明显差异，提示H. pylori定植于胃或肝所引起的病变相对独立，能否到达肝脏是引起肝脏病变的关键，而与胃组织病变严重程度无关。 以上结果证实，H. pylori除定植于胃黏膜引起胃炎、消化道溃疡以及胃淋巴瘤等疾病外，还可到达肝脏并作为独立的致病因素导致肝脏病变。我们推测：其致病模式可能为首先感染并定植于胃黏膜，通过破损的胃黏膜入血形成H. pylori菌血症，随血流入肝脏并定植；初期引起局灶性淋巴细胞浸润，随病情周期延长扩展至周围汇管区，长期炎症刺激引起纤维化间隔包裹并形成不典型增生性结节，甚至出现小细胞异型性增生、假腺样结构异型。本研究中虽然未直接观察到肝癌组织，但肝脏癌前病变如不典型增生和细胞、结构异型的出现，为H. pylori可能导致肝癌的发生提供了有力的证据。 参 考 文 献 [1]Fan XG, Peng XN, Huang Y, et al. Helicobacter species ribosomal DNA recovered from the liver tissue of chinese patients with primary hepatocellular carcinoma. Clin Infect Dis, 2002, 35: 1555-1557. [2]Huang Y, Fan XG, Wang ZM, et al. Identification of helicobacter species in human liver samples from patients with primary hepatocellular carcinoma. J Clin Pathol, 2004, 57:1273-1277. [3]Tian XF, Fan XG, Fu CY, et al. Experimental study on the pathological effect of Helicobacter pylori on liver tissues. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13:780-783. (in Chinese) 田雪飞，范学工，付春燕，等.幽门螺杆菌致肝脏病变的动物实验观察.中华肝脏病杂志，2005,13:780-783. [4]Tian XF, Fan XG, Zhang Y, et al. Establishment of a mouse model colonized by Helicobacter pylori. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2004, 12: 1313-1316. (in Chinese) 田雪飞，范学工，张艳，等.C57BL/6小鼠幽门螺杆菌感染动物模型的建立.世界华人消化杂志,2004,12:1313-1316. [5]Huang Y, Fan XG, Chen YP, et al. Detection of Helicobacter species 16Sr RNA gene in paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissues. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2002, 10: 877-882. (in Chinese) 黄燕,范学工,陈永平,等.肝癌组织中螺杆菌16S rRNA基因的检测.世界华人消化杂志,2002,10:877-882. [6]Ito K, Nakamura M, Toda G, et al. Potential role of Helicobacter pylori in hepatocarcinogenesis. Int J Mol Med, 2004, 13: 221-227. [7]Tian XF, Fan XG, Huang Y, et al. Isolate bacterium in paraffin-embedded tissues of hepatocellular carcinoma by laser capture microdissection technology and detection of Helicobacter species gene. Zhonghua Weishengwuxue He Mianyixue Zazhi, 2005, 25: 324-328. (in Chinese) 田雪飞，范学工，黄燕，等.应用激光捕获显微切割技术分离肝癌石蜡组织标本中细菌及螺杆菌基因的检测.中华微生物学和免疫学杂志,2005,25:324-328. [8]Wang X, Will閚 R, Svensson M, et al. Two-year follow-up of Helicobacter pylori infection in C57BL/6 and Balb/cA mice. APMIS, 2003, 111: 514-522. [9]Fukui T, Okazaki K, Tamaki H, et al. Immunogenetic analysis of gastric MALT lymphoma-like lesions induced by Helicobacter pylori infection in neonatally thymectomized mice. Lab Invest, 2004, 84: 485-492. [10]Huang Y, Fan XG, Tang ZS, et al. Detection of Helicobacter pylori DNA in peripheral blood from patients with peptic ulcer or gastritis. APMIS, 2006, 114: 851-856. 中华肝脏病杂志版权 |