【摘要】目的 应用原核表达系统表达HBV前S1蛋白反式调节基因2（PS1TP2），酵母双杂交技术筛选白细胞文库中与之结合的蛋白质，了解该基因产物在肝癌细胞系中的亚细胞定位。 方法 应用生物信息学初步探讨PS1TP2结构及功能。PCR扩增PS1TP2基因，构建pET32a(+)-PS1TP2表达载体，在大肠埃希菌Rosettap中进行诱导表达。构建pGBKT7-PS1TP2重组载体，应用酵母双杂交技术，在营养缺陷型培养基上筛选白细胞cDNA文库中与之结合的蛋白质。构建pEGFP-C1-PS1TP2表达质粒，转染肝癌细胞株HepG2，利用荧光显微镜和共聚焦显微镜观察PS1TP2的亚细胞分布。 结果 PS1TP2基因位于6q24.1，疏水指数较高。PS1TP2能在原核系统中表达，表达产物相对分子质量约4.1×104。酵母双杂交技术筛选出白细胞cDNA文库中与之结合的蛋白质26个。PS1TP2亚细胞定位于细胞质中。 结论 在原核表达系统中成功表达了PS1TP2，为抗体的制备奠定了基础。PS1TP2可与白细胞表达的某些蛋白质相互作用，在肝癌细胞系中定位于细胞质，为进一步探究HBV感染的发病机制提供了新线索。 【关键词】肝炎病毒，乙型； 生物信息学； 原核表达； 酵母双杂交； PS1TP2 Protein expression and function of gene 2 transregulated by hepatitis B virus pre-s1 protein and its cloning WANG Dan-qiong, GUO Jiang, CHENG Jun, ZHANG Jian-kang, ZHAO Long-feng, HONG Yuan, ZHANG Li-ying. Institute of Infectious Diseases, Beijing Ditan Hospital, Beijing 100011, China Corresponding author: CHENG Jun, Email: cj@ genetherapy.com.cn 【Abstract】Objectives To screen proteins in leukocytes interacting with PS1TP2 by yeast-two hybrid and to view their subcellular localization in HepG2 cells. Methods The function and structure of PS1TP2 were studied by bioinformatic analysis. PS1TP2 gene was amplified and cloned into plasmid pET32a (+) and pGBKT7 to construct recombinant expression vectors pET32a (+)-PS1TP2 and pGBKT7-PS1TP2. They were transduced into E. coli Rosetta strain and yeast AH109. The transformed yeast mated with yeast Y187 containing leukocyte cDNA library plasmid in a 2xYPDA medium. Diploid yeast cells were plated on a synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) for selecting twice and then screening. Then a green fluorescent protein (GFP) expression vector pEGFP-C1-PS1TP2 was established, transduced into HepG2, and its subcellular localization was studied by fluorescence microscopy and confocal microscopy. Results Bioinformatic analysis showed that the PS1TP2 gene was located at 6q24.1, the protein was unstable and the aliphatic index was very high. After transformation of the E. coli and yeast AH109, the expression protein showed: (1) the molecular weight of the expressed product was about 41 000 Da, and (2) PS1TP2 existed within the cells. Diploid yeast cells were plated on the synthetic dropout nutrient medium containing X-a-gal for selecting twice and then screening. Twenty-six colonies from blue colonies were sequenced, pEGFP-C1-PS1TP2 was successfully expressed in the HepG2 cells, and PS1TP2 was located in the cell plasma. Conclusion A prokaryotic expression vector pET32a(+)-PS1TP2 was constructed successfully and the PS1TP2 was successfully expressed in the yeast system. Genes of PS1TP2 interact with leukocyte proteins. These results bring some new clues for studying the biological functions of HBV. 【Key words】Hepatitis B virus; Bioinformatics; Prokaryotic expression; Yeast two-hybrid; PS1TP2 HBV是一种严重危害人类健康的致病因子，是导致急、慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌的主要原因[1-4]。HBV前S1蛋白主要存在于HBV Dane颗粒和管型颗粒表面，是HBV结合于肝细胞膜上特异性受体的主要蛋白质成分[5]，通过前S1相关蛋白介导病毒入胞[1]。前S1蛋白3～77位氨基酸均参与调节病毒成熟、分泌以及感染肝细胞[2]。前S1蛋白与HBV的复制指标有良好的一致性；与HBV的存在和复制关系密切[3]。应用抑制性消减杂交技术研究发现了一系列前S1蛋白反式调节的靶基因，其中包括HBV前S1蛋白反式激活蛋白2（PS1TP2）基因，其大小为573bp，功能尚不清楚[4]。为探讨其生物学功能，我们对其进行预测分析，然后进行原核表达，并用酵母双杂交技术筛选白细胞中与之结合的蛋白质，并了解该基因产物在肝癌细胞系中的亚细胞定位，为今后更加广泛深入的研究PS1TP2与HBV之间的相互作用和乙型肝炎的临床诊疗提供一些理论依据。 材料与方法 1. 主要实验材料和试剂：HepG2及DH5α细胞系为北京地坛医院传染病研究所保存；Rosetta购自美国Novagen公司；预转化的cDNA白细胞文库(Y187)、pEGFP-C1荧光表达载体均购自美国Clontech公司。Wizard pureFection磁珠法质粒提取试剂盒、Lipofectamine 2000细胞转染试剂盒购自美国Promega公司。玻璃奶回收试剂盒购自北京博大泰克公司，EcoRⅠ、BamHⅠ和Marker DL15000、DL2000购自日本TaKaRa生物公司，抗-His和抗C-myc单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自美国NEB公司，DAB显色试剂盒购自北京中山金桥公司，化学发光底物购自美国Pierce公司，其余化学试剂均为国产分析纯品。 2. 生物信息学分析：将该基因与NCBI BLASTn比对分析，确定其染色体定位；利用在线软件 (www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/)分析PS1TP2基因5′-侧翼区的CpG 岛；利用Promoter活性在线预测软件 (http://www.cbs.dtu.dk/servi-ces/Promoter/)和TRES Promoter（http://bioportal.bic.nus. edu.sg/tres/）同时分析启动子活性；利用（http://125.itba.mi.cnr.it/～webgene/wwwHC_polya.html）分析转录终止位点；应用ProtParam工具（www.expasy.ch/tools/protparam.html）对PS1TP2蛋白质一级结构的生物信息学预测；利用ProtScale（www.expasy.org/tools/protscale.html）做蛋白质的疏水性分析；利用（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）作Tmpred-跨膜结构分析；利用SignalP-信号肽预测工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/Sig-nalP/）分析蛋白质结构信号肽[6]。 3. PS1TP2的原核表达：提取HepG2细胞的总RNA，反转录为cDNA，用引物5′-GAATTCAT GTTTTTTCTGAACATTGC-3′（EcoRⅠ），5′-GGATCCTTTGATCTCCATCAGCATGG-3′（BamHⅠ）以cDNA为模板，应用PCR扩增目的基因PS1TP2[7]。PCR产物与pGEM-T载体连接，连接产物转化DH5α感受态菌株，进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落抽提质粒，EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定后测序。EcoRⅠ和BamHⅠ酶切目的基因片段与经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切的pET32a(+)表达载体连接，转化DH5α，提取质粒进行PCR以及酶切鉴定后，将重组质粒转化入表达菌Rosetta。阳性表达菌和对照菌过夜活化后转摇，培养至600nm波长吸光度值（A600）为1.0时加异丙基-βD-硫代半乳糖苷（IPTG）使其终浓度达到1mmol/L，37℃诱导培养1h。表达产物做样后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，经SDS-PAGE分离的目的蛋白转移到PVDF膜上，封闭后加鼠抗His单克隆抗体（第一抗体，1∶3000稀释）和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（第二抗体，1∶5000稀释），DAB法显色分析结果。 4. 酵母双杂交技术筛选PS1TP2蛋白的结合蛋白：构建pGBKT7-PS1TP2重组质粒，用醋酸锂法转化AH109酵母细胞，转化后铺板于SD/-Trp进行筛选。挑取2～3mm大小的菌落过夜培养后，提取酵母蛋白质。表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。挑取含有pGBKT7-PS1TP2质粒的AH109酵母菌落（直径>2mm）接种于SD/-Trp液体培养基中，30℃ 250r/min振摇至A600在0.8～1.0时，与400μl白细胞文库的酵母细胞Y187在2×YPDA 50ml中30℃、30～45r/min配合18～24h，观察到三叶草状的二倍体细胞后，将其重悬于10ml的0.5×YPD培养基中，铺150mm的SD/-Trp/-Leu/-His（三缺）平板和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade（四缺）平板，30℃培养至菌落出现。将在四缺培养基上生长的单克隆在铺有 X-α-Gal的四缺培养基上划线，30℃培养4～8d，蓝色菌落即为阳性菌落。提取阳性酵母质粒并用电穿孔法转化大肠杆菌[5]，在含有氨苄青霉素的LB平板培养，所获得菌落提取质粒后用BglⅡ酶切，证明有插入片段后测序，在GenBank数据库进行同源性分析。 5. pEGFP-C1-PS1TP2重组质粒转染HepG2细胞后显微镜观察：常规方法构建pEGFP-C1-PS1TP2重组质粒，磁珠法提纯的转染级质粒pEGFP-C1-PS1TP2、空载体pEGFP-C1分别转染HepG2细胞。转染24h后，荧光显微镜下数码相机拍照。 结 果 1. PS1TP2基因的生物信息学分析: 将PS1TP2基因测序结果进行BLASTn对比分析发现PS1TP2基因位于人染色体6q24.1（图1）。基因前端的5000bp（即6q24.1的80721～85720位）中发现1个约200bp的CpG岛，且在相同区域发现高启动子活性序列。该基因表达的蛋白质理论分子量为21703.0，pI为10.14，消光系数为28335 M-1·cm-1（280nm）；不稳定系数是40.58。该蛋白质疏水性预测最大值是3.333，最小值是-2.922，在3个区域的氨基酸有很强的疏水性；包括3个强跨膜螺旋，信号肽出现在第5个氨基酸附近，概率为0.987，可能的切割位点位于第18和第19个氨基酸之间。 2. PS1TP2基因在大肠杆菌中的表达：以HepG2细胞cDNA为模板扩增出目的片段后，成功构建了pET32a(+)-PS1TP2重组质粒并在Rosseta中用IPTG诱导表达，SDS-PAGE和Western blot分析表达蛋白质的相对分子质量约为4.1×104。 3. 酵母双杂交技术筛选PS1TP2蛋白的结合蛋白：含有pGBKT7-PS1TP2质粒的酵母菌株AH109与含有白细胞cDNA文库质粒的酵母菌株Y187配合23h时，在倒置显微镜下观察到了三叶草状二倍体细胞，说明酵母配合成功。在SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 平板上共挑取60个单克隆，在铺有X-α-gal的四缺培养基上划线，长出26个蓝色阳性克隆。筛选后的阳性克隆转化大肠杆菌，提取质粒后进行BglⅡ酶切后可看到不同大小白细胞cDNA文库片段。挑选26个克隆进行测序，测序结果与GenBank数据库进行初步比较，结果见表1。 表1 （略） 4. PS1TP2的亚细胞定位：pEGFP-C1-PS1TP2表达质粒成功地在HepG2细胞中表达，在荧光显微镜下可观察到胞质内有弥漫分布的绿色荧光，而细胞核内无荧光，推测PS1TP2亚细胞定位于细胞质中。为了确定PS1TP2的亚细胞定位，用蓝色染料hoechest染细胞核中的DNA，将转染pEGFP-C1-PS1TP2质粒的细胞置于激光共聚焦显微镜下观察，同一视野下观察到HepG2细胞核呈现蓝色，无绿色荧光分布，相反，细胞质中弥漫分布绿色荧光而无蓝色荧光出现，重叠后也是同样结果，确定PS1TP2定位于细胞质中，属于胞质表达蛋白质。 讨 论 HBV前S1蛋白是HBV包膜蛋白的重要成分之一。近年来，人们对其认识逐渐深入，发现其不仅在HBV附着、侵入肝细胞过程中起着关键作用[8，9]，还参与HBV病毒的装配、分泌[10，11]，调节HBV引起的细胞及体液免疫，增强新型基因疫苗的免疫效应[12]，提示前S1蛋白在慢性乙型肝炎的发生、发展过程中起着重要的作用。为了进一步研究其功能，应用抑制性消减杂交技术研究前S1蛋白的反式调节作用，筛选前S1蛋白反式调节的靶基因，推测其在体内的功能，发现了PS1TP2基因。生物信息学分析显示PS1TP2蛋白序列之前的几十个氨基酸具有跨膜结构的区域和信号肽特征，因此，推测这个蛋白质前端的信号肽还未被切除，很可能是在粗面内质网上合成并同时具有卷曲螺旋的膜蛋白质，可能为分泌型蛋白质。其疏水性的值变化范围为：-2.922～3.333，其中，氨基酸疏水性很强的区域有3个。 由于对PS1TP2的功能知之甚少，因而利用基因工程的方法表达PS1TP2基因，制备多克隆抗体用于临床检测是必经之路。大肠杆菌表达系统作为目前应用最广泛的原核表达系统，表达目的蛋白具有快速、高效、经济等很多优点[13]。pET32a（+）含有Trx、His等标签序列，有助于对表达产物进行检测。因此，选用pET32a（+）作为表达载体，并且上游引物中碱基的设计与载体相匹配，表达蛋白时使辅助蛋白融合到目的蛋白的N端。 很多实验证明，表达量随着诱导剂量的增加而增高，本研究中所采用0.1mmol/L IPTG进行诱导时，发现细菌生长已基本停止，而目的蛋白的表达则不明显，表明该蛋白可能对细菌有毒性作用。因此加大诱导剂的量短时间内高温诱导，最终发现1mmol/L IPTG，37℃，1h可见目的蛋白的表达。但表达蛋白以包涵体形式存在。SDS-PAGE结果显示融合蛋白与预测相符，通过Western blot检测证实此融合蛋白包含组氨酸标签。外源蛋白高水平表达过程中容易形成无活性的包涵体[14]，这是原核表达系统的一个缺陷，但以包涵体形式表达的蛋白容易纯化，且保留免疫原性。该蛋白的成功表达，为下一步制备多克隆抗体应用于免疫组织化学和酶联免疫吸附法的检测奠定实践基础。挑取阳性克隆26个筛选出与PS1TP2相互作用的蛋白基因14种，其中CD11a、MAPKBP1、G蛋白，丝/苏氨酸激酶17B、乳酸脱氢酶、转录因子EC、人CCR4-NOT转录复合物10等与细胞免疫、信号转导、能量代谢、转录调节有关。 国内外学者已有报道慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞（DC）功能明显低下，抗原呈递不足可能是导致HBV感染慢性化的原因之一。活化的DC表达CD11a、CD45等表面标志。人类白细胞抗原CD11a作为重链与CD18（CD11a/CD18）共同构成人类淋巴细胞功能抗原1（LFA-1），作为黏附分子在炎症和免疫反应发挥作用。在长期受损的肝脏，多种转录因子参与了调控生成大量细胞外基质蛋白以进行纤维性修复的过程。筛选得到的转录因子EC，有研究表明它在软骨肉瘤中表达增高[15]，但在肝纤维化以及肝脏肿瘤发生中的作用鲜见报道。丝裂原活化蛋白激酶是细胞内的一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。PS1TP2蛋白与MAPKBP1结合后，影响了丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路，进而对细胞的生长调节产生一定影响。Xu等[16]报道在卵巢癌组织表达谱研究中发现丝氨酸/苏氨酸激酶15显著上调。在肝癌组织中的表达鲜见报道，有待进一步研究。 在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察到PS1TP2蛋白定位在细胞质内，为胞质表达蛋白质，与生物信息学预测结果一致。生物信息学分析结果显示该蛋白前端有信号肽结构，推测其为一分泌型蛋白质，一般情况下，分泌蛋白是由信号肽介导，进入内质网，通过高尔基体进一步经过各种类型的翻译后加工，成为有特定结构和功能的蛋白质，然后分泌到细胞外。提示PS1TP2蛋白在体内发挥生理功能时，不局限于细胞内，也分泌到细胞外发挥作用。 HBV PS1TP2蛋白与宿主蛋白相互作用可能是病毒感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生发展的重要原因。用酵母双杂交法筛选与PS1TP2相互作用的蛋白，其中CD11a作为DC的表面标志，参与抗原呈递过程，它与PS1TP2蛋白作用后可能使DC抗原呈递功能受到影响，参与HBV感染慢性化过程；转录因子EC、人CCR4-NOT转录复合物10以及MAPKBP1可能参与了肝脏的纤维化修复过程；丝/苏氨酸激酶参与了卵巢癌的发生，是否与肝脏肿瘤发生相关尚需要进一步证实。这些都为研究HBV所致肝炎、肝硬化、肝细胞癌的发病机制提供了线索和思路。 参 考 文 献 [1]Cheng J, Yang SC. 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