【摘要】目的 对羟基喜树碱诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡前后的线粒体进行定量蛋白质组学研究。 方法 用羟基喜树碱诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡，提取线粒体并鉴定其纯度; 用可裂解的同位素标记的亲和标签技术标记线粒体蛋白质，利用二维液相色谱-串联质谱分析鉴定蛋白质。 结果 获得了羟基喜树碱诱导细胞凋亡前后的高纯度线粒体；分析鉴定了细胞凋亡前后，相对表达量差异有统计学意义的蛋白质74种，其中42种线粒体蛋白质在细胞凋亡后的表达量下调，32种蛋白质的表达量在凋亡细胞中上调。这些差异蛋白的分子功能主要表现为能量代谢和核酸的翻译、转录、复制以及细胞骨架等。 结论 获得了羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后的线粒体差异蛋白信息，将促进对癌细胞凋亡机制及羟基喜树碱药理作用的深入理解，同时，实验所采用的整合技术平台将有助于亚细胞定量蛋白质组学研究。 【关键词】喜树碱； 线粒体； 定量分析； 质谱 A quantitative analysis of mitochondrial protein differential expressions in hydroxycamptothecin-treated hepatoma cells YAN Yu-rong, FU Yu-rong, QIU Zong-yin. Key Laboratory of Laboratory Medical Diagnostics, Ministry of Education, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016,China Corresponding author: QIU Zong-yin, Email:zongyin@ sohu.com 【Abstract】Objective To investigate the differentially expressed mitochondrial proteins in hydroxycamptothecin (HCPT)-treated SMMC-7721 cells by using quantitative proteome. Methods SMMC-7721 cell apoptosis was induced by HCPT and the mitochondria were isolated with a mitochondria isolation kit. Mitochondrial proteins labeled with a cleavable isotope-coded affinity tag were identified and quantified using two-dimensional liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Results Highly purified mitochondria were obtained. Seventy-four mitochondrial proteins, which were statistically significantly altered (P < 0.05) in HCPT-treated cells, were identified and analyzed. A total of 42 proteins were significantly down-regulated, and 32 were up-regulated in the cells that responded to apoptosis. The functions of these proteins were likely involved in cell energy metabolism, nucleic acid translation and transcription, cytoskeleton, etc. Conclusion Our results about the information of differentially expressed mitochondrial proteins in HCPT-treated cells and the control cells will help to understand the mechanism by which HCPT induces cell apoptosis. The integrated techniques we used in this study will be helpful to the investigation of subcellular quantitative proteomics. 【Key words】Hydroxyamptothecin; Mitochondria; Quantitative analysis; Mass spectrum 羟基喜树碱（hydroxycamptothecin，HCPT）与拓扑异构酶I及DNA结合后，可阻断DNA在切口部位的修复，抑制DNA合成并导致双链DNA断裂，促使肿瘤细胞凋亡。但近年来有研究表明，喜树碱类抗癌药的细胞毒作用与其抑制拓扑异构酶Ⅰ生物学活性的效应并不一致[1]，提示喜树碱类抗癌药尚有其他抗癌机制。引起细胞凋亡的途径主要有两条：一条是死亡受体途径，另一条是线粒体凋亡途径，也是压力诱导的主要凋亡途径。根据人类基因组预测，线粒体有1000～2000种蛋白质，而目前只有约600个线粒体蛋白是从蛋白质水平鉴定出来的。因此线粒体蛋白质组的研究还有待于进一步深入[2]。我们对抗癌药物干预人肝癌细胞前后线粒体蛋白质组变化的研究结果表明，阿霉素、HCPT通过影响线粒体蛋白质组发挥作用[3-8]，HCPT可通过线粒体途径诱导肿瘤细胞发生凋亡，线粒体中与细胞增殖、细胞骨架、能量代谢等相关的许多蛋白质发生了变化[7, 8]。但是，由于二维凝胶电泳/基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术的局限性，还有许多差异表达蛋白质并未得到确认，并且仅对蛋白质进行鉴定并不能提供用以阐明蛋白质功能的全部信息，蛋白质表达量的差异是影响生物功能的重要因素。 本研究应用可裂解的稳定同位素标记亲和标签（cleavable stable isotope-coded affinity tag，c-ICAT）定量蛋白质组研究策略分析HCPT诱导SMMC-7721细胞凋亡前后的线粒体蛋白质变化，进一步阐明药物干预人肝癌细胞前后线粒体蛋白质组的总体变化，为深入探讨HCPT促肝癌细胞凋亡机制的研究提供新的实验依据。 材料与方法 1．细胞株与培养基：人肝癌细胞株SMMC-7721由重庆医科大学病理生理学教研室提供；RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司；新生小牛血清购自杭州四季青公司。 2．主要试剂及药品：HCPT注射液购自吉林天诚药业有限公司；细胞组分分离试剂盒和复合蛋白酶抑制剂购自美国Pierce公司；兔抗人细胞色素C抗体和FITC标记的羊抗鼠IgG购自美国Santa Cruz公司；小鼠抗人热休克蛋白60（HSP60）抗体和兔抗人β-肌动蛋白抗体购自美国Neomarkers公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔、羊抗鼠第二抗体购自武汉博士德公司；甘氨酸、十二烷基硫酸钠、30%聚丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺、蛋白质抽提试剂盒、蛋白质纯化试剂盒等购自美国Bio-Rad公司；c-ICAT试剂盒购自美国ABI公司；zip-tip柱购自美国Millipore公司。 3. 线粒体凋亡模型建立、线粒体提取及纯度鉴定：模型建立参照文献[4，6]方法。荧光显微镜观察线粒体跨膜电位的变化。线粒体提取按试剂盒说明书操作，主要过程如下：胰蛋白酶消化细胞并收集于离心管中，加入试剂盒中的试剂A混匀，冰上匀浆，将匀浆后的液体吸到原离心管中并加入试剂C，1000×g、4℃离心；转移上清液至新的洁净离心管中，3000×g、4℃离心；在沉淀中加入试剂C重悬，12000×g、4℃离心，沉淀即为线粒体。线粒体纯度鉴定：用HSP60、核组蛋白（Histone）、β-肌动蛋白和组织蛋白酶D（Cathepsin-D）分别作为线粒体、细胞核、细胞质和溶酶体的特异标记，用Western blot法对线粒体纯度进行鉴定。在收集的线粒体沉淀中加入2×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺上样缓冲液混匀，煮5min，离心、取上清液。取等量蛋白质进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳分离后，转移至PVDF膜，经5%脱脂奶粉封闭，分别加入小鼠抗人HSP60抗体、兔抗人Histone多克隆抗体、兔抗人β-肌动蛋白多克隆抗体、兔抗人Cathepsin-D多克隆抗体，4℃孵育过夜。加人HRP标记的羊抗兔IgG，室温孵育lh，DAB显色。实验重复3次。 4．线粒体蛋白质提取：分别收集正常和HCPT处理6h的细胞，分离线粒体。抽提线粒体蛋白质按试剂盒说明书在冰上进行：加入裂解液，强烈震荡混匀，匀浆，4℃离心30min，收集的上清液即为蛋白质提取物组分。用考马斯亮蓝法对蛋白质进行浓度测定，液氮保存。 5．c-ICAT分析：技术路线如图1所示。（1）标记：取对照组（正常SMMC-7721细胞）和实验组（HCPT诱导凋亡的SMMC-7721细胞）蛋白质样品各200μg，分别用ReadyPrepTM 2-D Clean-up试剂盒沉淀蛋白质。加入变性缓冲液和还原试剂溶解、离心，再将溶液放入沸水中煮10min，冷却至室温；将对照组溶液转移到盛有c-ICAT重试剂的管中，实验组溶液移入盛有c-ICAT轻试剂的管中，于37℃温育2h。（2）酶解：将标记轻试剂的实验样品与标记重试剂的对照样品合并为一管，加入碳酸氢铵调节pH至8.3，脱盐后，按质量比1∶50加入胰蛋白酶于37℃温育过夜。（3）强阳离子交换色谱/亲和色谱纯化标记肽：加入阳离子交换上样缓冲液稀释样本混合物并调节pH值至2.5～3.3，将样本混合物以1滴/s速度缓慢注入pH3.0的高分辨率阳离子交换柱上，再缓慢注入阳离子交换洗脱缓冲液洗脱柱上的肽，收集洗脱组分；加入亲和上样缓冲液于上述组分管中，调节pH至7.0，将溶液缓慢注入亲和柱，再依次注入亲和上样缓冲液、亲和洗脱缓冲液1、亲和洗脱缓冲液2，弃去开始流出的50μl洗脱液并收集其余洗脱液；在一真空浓缩离心机内蒸发亲和洗脱组分至干燥。（4）标记肽的裂解：向上述组分中加入裂解剂，于37℃温育2h，离心后于真空浓缩离心机内蒸发样本至干燥。（5）反相高效液相色谱-串联质谱分析：将已裂解开的样品用LC-PACKING纳升级二维高效液相色谱（仪器购自美国DIONEX公司）分离后直接用Qstar XL电喷雾四级杆飞行时间串联质谱（仪器购自美国Applied Biosystems公司）在线检测。具体方法：冻干样品用2%～5%乙腈和0.1%甲酸溶液溶解后上样到强阳离子交换柱，上样体积50μl（蛋白质约200μg）；洗脱液采用浓度为0、50、100、200、400、800、1000、2000mmol/L的醋酸铵溶液，每个浓度洗脱下来的样品富集在前置柱上，然后进入第二维的反相色谱，洗脱组分A（0.1%甲酸溶液），洗脱组分B（0.1%甲酸乙腈溶液），采用梯度洗脱方式：组分B含量由5%梯度上升至65%，洗脱时间120min，流速300nl/min。质谱方法：质谱离子源为纳升喷雾，喷雾电压3000V，数据采集为IDA模式，一级质谱扫描1s，扫描范围质荷比400～1600；二级质谱是选一级质谱中最强的3个离子（带2个或3个电荷）为母离子，每个二级质谱扫描时间3s，扫描范围质荷比为100～2000。仪器控制软件为Analysist QS 1.0。（6）生物信息学分析：质谱数据用Pro ICAT软件分析处理，数据库为Internatioanl Protein Index 307。 结 果 1．线粒体纯度鉴定：Western blot结果表明，提取的细胞器组分检测到了线粒体特异蛋白质HSP60，而没有检测到细胞核特异蛋白质Histone、细胞质特异蛋白质β-actin和溶酶体特异蛋白质Cathepsin-D（图2），说明提取的细胞器组分是线粒体，纯度较高，可用于下游的蛋白质组分析。 2．c-ICAT分析测试：利用Pro ICAT软件系统，数据库搜索结果见表1。鉴定的119种蛋白质中有91种有统计学意义，同时获得了其中74种蛋白质的相对表达量信息，表达量变化幅度最大的20种蛋白质信息见表2。检出的蛋白质中，氨基酸代谢与脂肪酸代谢相关蛋白质7种，能量代谢相关蛋白质13种，功能未知与假想类蛋白质11种，与核酸的翻译、转录、复制相关类蛋白质12种，与离子转运、离子通道和蛋白质运输相关类蛋白质10种，应激和免疫类8种，蛋白翻译和核糖体类10种，细胞增殖与凋亡类5种，细胞骨架和整合膜蛋白类10种，其他5种。其中42种蛋白质在肝癌细胞线粒体中有高表达量，HCPT诱导细胞凋亡后下调；32种蛋白质的表达量在凋亡细胞中上调。鉴定的线粒体蛋白质的功能分类（依据数据库中的信息进行分类）见图3。 讨 论 亚细胞蛋白质组学能够有效弥补目前蛋白质组研究方法学上的不足，其前提保障与难点是亚细胞器的高纯度。本实验采用特异抗体检测鉴定了提取的线粒体纯度，结果表明其纯度较高，为后续蛋白质组结果的可行性分析提供了保障。定量蛋白质组学的研究策略在重大疾病致病机制以及药理作用机制的研究中的应用日益增多，而基于二维液相色谱-串联质谱“鸟枪法”蛋白质组学方法的c-ICAT策略是其中的导向性技术。这种技术建立在一种新型的化学反应试剂c-ICAT基础上，相对目前其他定量蛋白质组研究方法优点明显[9-13]。我们的研究结果显示，强碱性（pH10.45）蛋白质60S核糖体L3样蛋白和强酸性（pH 4.54）蛋白质肾脏和肝脏脯氨酸脱氢酶1、相对分子质量最大（469000）蛋白质DNA依赖蛋白激酶催化亚基的拼接异构体1、相对分子质量最小（11700）蛋白质钙离子结合蛋白均有定性和定量信息。 本研究结果显示，在经HCPT处理后的细胞线粒体中，多种蛋白质的表达量发生大幅度改变，其中表达量改变35%以上的上调和下调蛋白质各10个。溶质载体家族3成员是一类对二盐基和中性氨基酸运输起催化作用的膜蛋白，在许多器官中高表达，该蛋白质的缺损可导致最常见的遗传性氨基酸尿症胱氨酸尿[14]，可能与肾功能密切相关[15]。本实验结果显示，溶质载体家族3成员在HCPT处理后的肝癌细胞中表达量减半，提示它可能在细胞凋亡过程中有重要作用。电子转移黄素蛋白β亚型是定位于线粒体基质的富含于肝脏、心脏和骨骼肌的蛋白质，充当数种脱氢酶的特异电子受体，通过电子转移黄素蛋白辅酶Q氧化还原酶将电子传递到重要的线粒体呼吸链，其蛋白质缺损是多重酰基辅酶A脱氢酶不足，即戊二酸尿症Ⅱ型的致病因素之一。电子转移黄素蛋白β亚型在HCPT诱导凋亡的肝癌细胞中表达量下调1倍，提示其在HCPT的抗癌机制和促癌细胞凋亡进程中有不可忽视的作用。细胞色素C-亚铁血红素裂合酶是线粒体内膜蛋白，其分子功能是将亚铁血红素基团共价连接到凋亡蛋白细胞色素C，在生物学过程中起电子传递作用，它在HCPT处理后细胞中的表达量也下调了67%。与电子传递相关的能量代谢类蛋白在凋亡癌细胞中的明显下调进一步说明呼吸链功能异常可活化凋亡信号途径，原因可能是线粒体对呼吸链复合体产生的高效率的超氧自由基反应的结果。本实验结果还显示，与核酸的翻译、复制、转录相关类蛋白质的表达量在凋亡细胞中呈普遍下调趋势，提示HCPT很可能通过作用于这类蛋白质发挥抑癌作用。 肌动蛋白素1是广泛分布于细胞内的构成细胞核和细胞质的肌动蛋白的重要成分，通过切断肌动蛋白丝和增加解聚作用在肌动蛋白动力中发挥重要作用，其活性通过磷酸化和去磷酸化以pH依赖模式可逆调节，它通过调节肌动蛋白细胞骨架改型影响包括细胞能动性、黏附性和细胞分裂在内的细胞的许多活性。本实验结果显示，肌动蛋白素1在凋亡肝癌细胞中的表达量翻倍，可以解释为，在一般情况下，线粒体形态的变化是受机体正常调节的，但在某些情况下，线粒体形态的变化与细胞凋亡或线粒体疾病相关，细胞骨架参与了细胞凋亡，并在细胞凋亡过程中扮演着重要的角色[16]。Ras相关蛋白Rab-7与内吞转运相关，对吞噬体变异发挥作用，属于凋亡相关蛋白，它在HCPT处理后的凋亡细胞中表达量上调近1倍。核糖体蛋白质在细胞的生长与凋亡过程中发挥着重要作用，我们的实验结果进一步证明了这一结论，即在用HCPT处理细胞使其发生凋亡后，核糖体蛋白S3a、40S核糖体蛋白S8、40S核糖体蛋白S5、类60S核糖体L3蛋白的表达量均明显上调。 综上所述，我们获得了HCPT诱导肝癌细胞凋亡前后的线粒体蛋白质的相对表达量信息，为从蛋白质水平进一步阐明HCPT诱导肝癌细胞发生凋亡的机制打下了基础。 参 考 文 献 [1]Tian XF, Lu SQ. Studies of the inhibitor of DNA topoisomiases and its anti-pneumocystis carinii effects. Jishengchong Yu Yixuekunchong Xuebao, 2005, 12: 52-56. (in Chinese) 田喜凤,卢思奇.DNA拓扑异构酶抑制剂及其抗卡氏肺孢子虫的研究进展.寄生虫与医学昆虫学报,2005,12:52-56. [2]Sun AH, Jiang Y, He FC. Research advances in expression profiling of mitochondrial proteins. Yichuan, 2006, 28: 1311-1315. (in Chinese) 孙爱华,姜颖,贺福初.线粒体蛋白质表达谱的研究进展.遗传，2006,28:1311-1315. [3]Li X, Pan W, Qiu F, et al. Two-dimensional gel electrophoresis of subcellular fractions of hepatoma cells. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 271-273. (in Chinese) 李兴，潘卫，邱峰,等.肝癌细胞亚细胞组分的双向凝胶电泳分析.中华肝脏病杂志，2005,13:271-273. [4]Fu YR, Qiu ZY, Yan YR. Effect of hydroxycamptothecin on apoptosis-inducing factor(AIF) expression and on AIF translocation in human hepatocellular cancer cell SMMC-7721. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2006, 14: 285-288. (in Chinese) 付玉荣，邱宗荫，颜玉蓉.羟基喜树碱诱导SMMC-7721细胞凋亡时线粒体凋亡诱导因子的转位研究.中华肝脏病杂志,2006,14:285-288. [5]Li X, Pan W, Qiu F, et al. Proteomic approach to the effect of Epirubicin on hepatoma cells at subcellular level. Fenzi Xibao Shengwu Xuebao, 2006, 39: 407-413. (in Chinese) 李兴,潘卫,邱峰,等.表阿霉素对肝癌亚细胞蛋白质组影响的研究.分子细胞生物学报，2006,39:407-413. [6]Fu YR, Yi ZJ, Yan YR, et al. Hydroxycamptothecin-induced apoptosis in hepatoma SMMC-7721 cells and the role of mitochondrial pathway. Mitochondrion, 2006, 6: 211-217. [7]Fu YR, Yi ZJ, Yan YR, et al. Changes in the protein spectrum of mitochondria isolated from hydroxycamptothecin-treated hepatoma cells. Anticancer Drugs, 2007, 18: 1045-1052. [8]Fu YR, Yi ZJ, Yan YR, et al. Proteomic analysis of mitochondrial proteins in hydroxycamptothecin-treated SMMC-7721 cells. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2007, 15: 572-576. (in Chinese) 付玉荣,伊正君,颜玉蓉,等.羟基喜树碱诱导SMMC-7721细胞线粒体跨膜电位耗散的蛋白质组分析.中华肝脏病杂志,2007,15:572-576. [9]Gygi SP, Rist B, Gerber SA, et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol, 1999, 17: 994-999. [10]Li J, Steen H, Gygi SP. Protein profiling with cleavable isotope-coded affinity tag (cICAT) reagents: the yeast salinity stress response. Mol Cell Proteomics, 2003, 2: 1198-1204. [11]Oda Y, Owa T, Sato T, et al. Quantitative chemical proteomics for identifying candidate drug targets. Anal Chem, 2003, 75: 2159-2165. [12]Hansen KC, Schmitt-Ulms G, Chalkley RJ, et al. Mass spectrometric analysis of protein mixtures at low levels using cleavable 13C-isotope-coded affinity tag and multidimensional chromatography. Mol Cell Proteomics, 2003, 2: 299-314. [13]Karsan A, Pollet I, Yu LR, et al. Quantitative proteomic analysis of sokotrasterol sulfate-stimulated primary human endothelial cells. Mol Cell Proteomics, 2005, 4: 191-204. [14]Palac韓 M, Kanai Y. The ancillary proteins of HATs: SLC3 family of amino acid transporters. Pflugers Arch, 2004, 447: 490-494. [15]Stuart RO, Pavlova A, Beier D, et al. EEG1, a putative transporter expressed during epithelial organogenesis: comparison with embryonic transporter expression during nephrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol, 2001, 281: 1148-1156. [16]Gourlay CW, Ayscough KR. Identification of an upstream regulatory pathway controlling actin-mediated apoptosis in yeast. J Cell Sci, 2005, 118: 2119-2132. 中华肝脏病杂志版权 |