【关键词】 肝损伤; 脂多糖; 内皮细胞; SSeCKS Expressions of src-suppressed C kinase substrate in lipopolysaccharide injured rat livers JIANG Wen, SHAO Jian-guo, LIU Hai-ou, LU Jian-rong, SONG Lei. 【Key words】 Liver injury; Lipopolysaccharide; Endothelium; Src-suppressed C kinase substrate 【First author address】 Nantong Third People’ Hospital, Nantong University, Nantong 226000, China Email: jw_jiangwen1234@ 163.com 蛋白激酶C（PKC）作为信号转导主要成员而参与内毒素诱导肝损伤[1, 2]。然而，目前关于PKC参与内毒素肝损伤的分子机制尚不明确。Src抑制的蛋白激酶C的底物（SSeCKS）为一种新发现的支架蛋白，通过锚定主要信号调节因子蛋白激酶C（PKC）而调节其与下游底物的结合，从而辅助调控细胞因子的分泌和有丝分裂[3，4]。有研究表明，SSeCKS是一种炎症反应蛋白，在内毒素小鼠模型中发现SSeCKS在多个组织中表达增加[5]。对内毒素肝损伤中SSeCKS表达变化的研究鲜见报道。因此，我们检测了脂多糖（LPS）诱导肝损伤过程中SSeCKS的表达情况及其细胞定位。 一、材料与方法 1．实验材料：LPS、羊抗大鼠SSeCKS抗体购自美国Sigma公司；Trizol、引物和Taqman探针购自美国Invitrogen公司；地高辛标记RNA探针试剂盒和原位杂交检测试剂盒购自瑞士Roche公司；兔抗凝血因子Ⅷ（factor Ⅷ associated antigen）抗体（购自丹麦Dako公司）；其他试剂均为国产AR级分析纯品。 2. 实验方法：（1）动物处理和分组：健康普通级SD大鼠随机分为10组，每组6只，分别为正常对照组、按LPS剂量（1、5、10、15mg/kg）分为4组；LPS 5mg/kg注射后不同时间（1、3、8、12、24h）分为5组。LPS腹腔注射，在相应时间点处死大鼠，取肝组织。（2）苏木素-伊红（HE）染色：取甲醛固定组织, 石蜡包埋, 4μm切片, 常规HE染色后光镜下观察肝小叶、肝窦、肝细胞等形态学改变。（3）实时定量PCR检测:目的基因SSeCKS引物序列为：上游引物5′-TGAAGGCGAAGGGGCAGAA-3′，下游引物5′-CT TCTTGCTTCTCTGTGGATTGC-3′,探针序列为5′(FAM)-TCGGAGCAGGAGACCACCAAGAGCC-(TAMRA)-3′；内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物序列为：上游引物5′-CCATTTGCAGTGGCAAAG-3′,下游引物5′-CA CCCCATTTGATGTTAGTG-3′，探针序列为5′(FAM)-CAAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTC-(TAMRA)3′。SSeCKS基因的表达计算方法：以同一份标本SSeCKS拷贝数/GAPDH拷贝数表示SSeCKS基因的表达水平，定义为SSeCKSN。（4）原位杂交：采用SSeCKS cDNA寡核苷酸探针,经地高辛标记,检测SSeCKS表达情况，操作按试剂盒说明书进行。（5）Western blot: 肝组织用RIPA裂解液抽提蛋白，以BCA方法测定蛋白质浓度。每一标本取20μg总蛋白质，经6% SDS-PAGE电泳分离，蛋白质条带转移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1h，TBST洗涤3次，加入抗SSeCKS抗体室温孵育1h，4℃过夜，TBST洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体室温孵育1h，TBST洗涤3次，用电化学发光法进行检测。（6）间接免疫荧光: 冰冻切片先用0.3% Triton X-100/PBS通透30min，再用5%正常兔血清封闭1h，切片用绵羊抗－SSeCKS多克隆抗体（1∶200）和抗Ⅷ因子抗体（1∶200）室温孵育2h，4℃孵育过夜，PBS洗3遍，用异硫氰酸荧光素标记的驴抗绵羊抗体（1∶200）和四甲基异硫氰酸罗丹明标记的羊抗兔抗体（1∶200）4℃孵育2h，PBS洗3遍，用缓冲甘油封片，在LeicaDM5000荧光显微镜下观察。 3. 统计学处理：用State7.0软件对相关数据资料进行统计处理。两样本均数比较用t检验；多组数值变量资料间比较用单因素方差分析。 二、结果 1. 病理学检查：腹腔注射LPS 8h，模型组肝细胞出现散在坏死灶，肝窦轻度扩张，炎性细胞浸润，12h肝细胞水变性伴明显小灶性坏死及炎细胞侵润灶，肝窦扩张明显，窦壁内皮细胞肿胀。正常对照组肝细胞没有坏死和炎性细胞浸润。 2．大鼠肝组织中SSeCKS mRNA的表达：（1）不同剂量LPS致伤大鼠肝脏中SSeCKS mRNA表达的比较：腹腔注射LPS 8h后肝脏SSeCKS mRNA的量随LPS剂量增加（0～5mg/kg）而逐渐增高，5mg/kg组表达量最高（P<0.05）, LPS 10～15mg/kg时表达逐渐降低，见图1A。（2）不同时间LPS致伤大鼠肝组织中SSeCKS mRNA表达的比较。SSeCKS mRNA在腹腔注射LPS后1～8h逐渐增高，8h表达量最高（P<0.05），24h SSeCKS mRNA水平依然高于正常水平（P<0.05），见图1B。 3. 原位杂交检测大鼠肝脏SSeCKS mRNA的表达：正常肝组织中仅有少量SSeCKS阳性细胞，5mg/kg LPS腹腔注射8h后肝窦周围阳性信号明显增多，染色增强。 4. Western blot检测大鼠肝脏SSeCKS蛋白质的表达：（1）不同剂量LPS致伤大鼠肝脏中SSeCKS蛋白质表达变化：腹腔注射LPS 8h后肝脏SSeCKS蛋白质的量随LPS剂量增加（0～5mg/kg）而逐渐增高，5mg/kg组表达最高，10～15mg/kg LPS刺激时表达逐渐降低，见图2A。（2）不同时间LPS致伤大鼠肝组织中SSeCKS蛋白质表达变化。SSeCKS蛋白质在腹腔注射LPS后3h逐渐增高，12～24h表达最高。见图2B。 5. 免疫荧光双标记定位SSeCKS在肝窦微血管内皮细胞的表达：正常肝组织仅有少量SSeCKS阳性细胞；而5mg/kg LPS腹腔注射8h后肝窦周围阳性信号明显增多。 三、讨论 LPS与细胞膜上的受体结合后可激活细胞内的多条信号转导通路，如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、PKC通路、核因子-κB（NF-κB）通路等，而且MAPK通路及NF-κB通路也可通过PKC途径激活，从而诱导细胞内多种炎性介质大量产生[6, 7]。故PKC活化在内毒素炎症所致肝损伤过程中发挥重要作用，但PKC发挥作用的分子机制还鲜见报道。SSeCKS是一类新发现的PKC结合蛋白和底物，因此，我们观察LPS诱导肝损伤模型中SSeCKS的表达变化和细胞定位，以探讨PKC参与其肝损伤的机制。 本研究结果显示，LPS诱导肝组织SSeCKS表达增加具有时间和剂量依赖关系，提示肝脏SSeCKS的表达变化可能与内毒素肝损伤相关。免疫荧光双标记结果显示内毒素肝损伤SSeCKS的表达定位于肝窦内皮细胞，提示SSeCKS的表达与内皮细胞炎症表型的改变相关。内皮细胞是肝脏炎症反应的重要炎症反应细胞。内皮细胞在受到炎症刺激后，发生炎性表型的改变，细胞表面黏附分子表达增加，炎症细胞因子分泌增加，内皮细胞形态发生收缩。这与内毒素致伤小鼠肝窦内皮细胞SSeCKS表达上调与内皮细胞吞噬功能增强相关的观点一致[8]。 SSeCKS能与细胞信号通路中的一个或多个激酶成分结合，或者可以把特定的信号分子结合在一个蛋白复合物中，从而把几个不同的信号级联通路彼此分开或者拉近，以达到选择性激活或者抑制某些信号的传导，调节反应的特异性和强度。但SSeCKS与内皮细胞炎症信号通路关系的研究尚少。本研究结果显示在炎症肝损伤过程中存在着SSeCKS的过度表达，提示SSeCKS的过度表达与炎症有关，在炎症发生发展过程中起重要作用。因此，进一步研究内毒素肝损伤炎症反应过程中SSeCKS的作用可为寻找新的有效的炎症干预靶点提供基础。炎症反应过程中SSeCKS过表达的相关机制仍有许多问题尚待阐明。 参 考 文 献 [1]Vouyouka AG, Jiang Y, Rastogi R, et al. 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