【关键词】 双杂交系统技术； 视黄醇结合蛋白质类 Screening and cloning of encoding genes of proteins interacting with retinol dehydrogenase 11 using yeast two-hybrid technique LI Yue, WANG Qi, CHENG Jun, LIN Yuan, FAN Wan-hu, YUAN Ju, HONG Yuan. 【Key words】 Two-hybrid system techniques; Retinol-binding proteins 【First author address】 Institute of Infectious Diseases, Beijing Ditan Hospital, Beijing 100011, China Corresponding author: CHENG Jun, Email: cj@ genetherapy.com.cn 视黄醇脱氢酶11（RDH11）广泛存在于视网膜、心脏、肝脏、胰腺、脑、睾丸和肾脏组织，在前列腺高水平表达，与前列腺癌的发生、发展密切相关[1-3]。在以HCV核心蛋白作为诱饵对肝细胞cDNA文库进行筛选的研究中，我们发现一个能与核心蛋白结合且功能未知的新基因，命名为HCV核心蛋白结合蛋白12（HCBP12），后来证明其为RDH11[4，5]。慢性丙型肝炎也是一种代谢性疾病[6]，代谢异常是HCV慢性感染发病机制的重要组成部分。HCV核心蛋白可以与RDH11结合，可能通过改变其酶学催化作用导致肝脏正常代谢途径的紊乱。我们构建了RDH11的真核表达载体，应用酵母双杂交技术筛选RDH11蛋白在肝细胞中相互作用的蛋白，并对筛选出的新基因进行了克隆化。 一、材料与方法 1. 材料：HepG2细胞系为北京地坛医院传染病研究所保存。AH109酵母菌、预转化的肝cDNA文库（Y187）、pGBKT7 DNA结合结构域克隆载体、X-α-半乳糖苷酶、酵母YPDA培养基、SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基均购自美国Clontech公司。Taq酶购自北京鼎国生物公司，限制性内切酶购自日本TaKaRa公司，T4 DNA连接酶、异丙基-b-d-硫代半乳糖苷和X-β-半乳糖苷酶购于美国Promega公司，抗c-Myc单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG和二氨基联苯胺显色试剂盒购自北京中杉生物公司。胰蛋白胨和酵母提取物购自英国Oxoid公司。半硫酸腺苷和醋酸锂购自美国Sigma公司。引物合成及测序由美国Invitrogen公司完成。 2．方法：（1）pGBKT7-RDH11的构建：根据RDH11基因序列设计引物，上、下游引物序列分别为5′-CATATG CAATGTCATGGACACCCAC-3′（NdeⅠ）和5′-CCCGGGCAGAAAGAAACAGGGTGAGG-3′（SmaⅠ），下划线部分为酶切位点。以来源于HepG2细胞的cDNA为模板进行PCR扩增，获得RDH11全长序列。回收目的基因片段经T-A克隆后插入pGBKT7表达质粒中构建pGBKT7-RDH11“诱饵”质粒。（2）pGBKT7-RDH11转化酵母细胞及阳性克隆的筛选：“诱饵”质粒转化酵母细胞AH109并铺板于SD/-Trp进行筛选，随机挑取直径＞2mm的菌落进行菌落PCR鉴定。（3）RDH11重组蛋白质的SDS-PAGE及Western blot鉴定：提取阳性酵母总蛋白进行SDS-PAGE，并用抗c-Myc单克隆抗体为第一抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG作为第二抗体进行Western blot分析，未转化质粒的酵母总蛋白作为阴性对照。（4）诱饵与肝细胞文库酵母配合：挑取新鲜生长且鉴定正确的AH109酵母菌落接种于SD/-Trp液体培养基中，30℃振摇，A600为0.8～1.0时离心并重悬于2×YPDA培养基，与含肝细胞文库的酵母细胞于30℃ 30～45r/min配合24h。观察到三叶草状二倍体细胞后，离心并重悬于0.25×YPDA培养基中，然后铺15cm的SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板各25块，置30℃孵箱培养。同时将配合产物按1∶10、1∶100和1∶1000分别铺于SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp和SD/-Leu培养基上检验配合效率。生长16d后将直径＞2mm的菌落划线于铺有X-α-半乳糖苷酶的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上以检测X-α-半乳糖苷酶活性。（5）阳性质粒的克隆及分析：挑取阳性菌落于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade液体培养基中振摇4d后提取文库质粒，转化大肠杆菌并于LB/Amp平板上培养，所获得菌落质粒行BglⅡ酶切鉴定后测序。测序结果进行同源性比对，所获得的新基因命名为HCBP12结合蛋白A（HCBP12BPA），存入GenBank数据库。（6）RDH11结合蛋白的克隆化：根据RDH11结合蛋白基因序列设计引物，上、下游引物序列分别为5′-CCCGGGATGAAGC TAAGGTTGGAT-3′（SmaⅠ）和5′-GGATCCCCAACAT CTCCAGAGAGC-3′（BamHⅠ），下划线示酶切位点。PCR扩增获得RDH11结合蛋白基因片段后进行T-A克隆，并通过双酶切和DNA测序对其进行鉴定。 二、结果 1．pGBKT7-RDH11重组质粒的构建：电泳结果表明重组表达载体pGBKT7-RDH11构建成功（图1）。 2．酵母细胞表达产物分析：提取转化了pGBKT7-RDH11质粒的酵母蛋白和未转化质粒的酵母总蛋白并进行SDS-PAGE和Western blot分析，Western blot结果显示转化pGBKT7-RDH11的酵母蛋白提取物可见大小正确的目的蛋白条带（图2）。 3．部分筛选克隆质粒BglⅡ酶切鉴定结果：对筛选到的肝细胞文库质粒进行BglⅡ酶切，琼脂糖凝胶电泳后获得大小不同的肝细胞cDNA文库片段（图3）。 4. cDNA测序与同源性分析：挑选30个克隆测序与GenBank数据库进行简单比较，其中1个克隆为新基因，其余均与已知基因的部分序列高度同源：人类载脂蛋白CⅠ基因、人类线粒体蛋白基因、人类AD-014蛋白基因、人类β-2微球蛋白基因、人类小囊泡相关膜蛋白相关蛋白A类似物基因、人类金属硫蛋白-2A基因、人类载脂蛋白B基因、人类羧酸脂酶4基因、人类丝氨酸蛋白酶抑制剂基因、人类天冬酰胺酰tRNA合成酶2基因同源性为100%，人类酰基肉毒碱移位酶20基因同源性为98%，人类白蛋白基因同源性为99%。 5．新基因序列的鉴定和克隆化：RDH11结合蛋白基因全长189bp，编码63个氨基酸。该序列已在GenBank登录，登录号DQ499468。随后通过PCR获得RDH11结合蛋白基因片段，SmaⅠ和BamHⅠ双酶切及测序均证实克隆化成功。 三、讨论 我们以RDH11为“诱饵”蛋白，应用酵母双杂交系统对正常人肝细胞cDNA文库进行筛选，发现RDH11可以与人载脂蛋白C-Ⅰ、人金属硫蛋白-2A、人β-2微球蛋白、人载脂蛋白B、人羧酸脂酶、人丝氨酸蛋白酶抑制剂和人白蛋白等已知功能蛋白相互作用。金属硫蛋白-2A的功能极为广泛，涉及重金属解毒、清除自由基、抗辐射、修复组织损伤、抗衰老、调节微量元素平衡、细胞增殖及凋亡、多种肿瘤的发生发展和肿瘤耐药等过程[7，8]。丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类丝氨酸蛋白酶活性调节剂，它至少包括10个家族，参与凝血、纤维蛋白溶解、补体激活、炎症反应和组织重建过程。肝细胞生长因子激活剂抑制因子1是一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，它可能与肿瘤的转移或发展相关。载脂蛋白是脂蛋白的重要组分，涉及脂蛋白的合成、分泌、成熟和降解的各个代谢过程。载脂蛋白C主要存在于极低密度脂蛋白中，分为CⅠ、CⅡ和CⅢ 3个亚型，其中，CⅠ型具有激活卵磷脂-胆固醇酰基转移酶的功能。 虽然目前尚不能完全正确地评估酵母双杂交筛选结果的价值，但是它实现了基因结构与功能最终结合为一体的目标。随着酵母杂交体系的不断完善、应用及结果处理方面经验的积累，基于双杂交原理而建立的一系列方法必将会成为生命科学发展的强大推动力。在本研究中，我们还发现了RDH11的肝细胞结合蛋白新基因RDH11结合蛋白，并对其进行了克隆化研究。因为我们相信，当前对HCV核心蛋白生物学功能及其在HCV致病机制的认识方面可能存在着很大的局限性，研究着眼点也有可能遗漏了很多更关键的因素，而新基因的发现可能为今后的科研工作提供新的方向。 参 考 文 献 [1]Kedishvili NY, Chumakova OV, Chetyrkin SV, et a1. 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Identification and characterization of retinol dehydrogenase 11 as a hepatitis C virus core protein-binding protein by yeast-two hybrid technique. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2004, 12: 286-290. (in Chinese) 成军,李克,王琳,等.丙型肝炎病毒核心蛋白结合视黄醇脱氢酶11蛋白.世界华人消化杂志,2004,12:286-290. [6]Koike K. Hepatitis C as a metabolic disease: Implication for the pathogenesis of NASH. Hepatol Res, 2005, 33: 145-150. [7]Kang YJ. Metallothionein redox cycle and function. Exp Biol Med (Maywood), 2006, 231: 1459-1467. [8]Cherian MG, Jayasurya A, Bay BH. Metallothioneins in human tumors and potential roles in carcinogenesis. Mutat Res, 2003, 533: 201-209. 中华肝脏病杂志版权 |