【关键词】 肝纤维化； 小鼠； 白细胞介素-10； 刀豆蛋白Ａ The action and possible mechanism of IL-18 and anti-IL-18 in preventing immune hepatic fibrosis induced by concanavalin A injection in a mouse model TAN You-wen, WU Jian-cheng. 【Key words】 Liver fibrosis; Mice; Interleukin-10; Concanavalin A 【First author’s address】 Department of Hepatitis, Third People’s Hospital of Zhenjiang, Zhenjiang 212000, China Email: tyw915@ sina.com IL-18可上调IFNγ、TNFα，介导细胞凋亡，下调IL-10；与IL-4协同作用提高IL-12等Th2细胞因子的表达，这些均提示IL-18参与了肝纤维化过程[1]。Zhang等[2]用IL-18转染血吸虫肝纤维化的脾细胞，使脾细胞持续表达IL-18，结果显示可阻止血吸虫肝纤维化的发展。为此，我们用IL-18及其抗体对刀豆蛋白Ａ诱导构建的肝纤维化模型鼠进行干扰，并探讨其作用机制。 一、材料与方法 1. 实验动物：BABL/c小鼠80只，体质量20g左右，购自上海动物实验中心。所有小鼠饲养于苏州大学动物房,适应环境1周后开始实验。 2. 药物与试剂：鼠IL-18 2.5mg（纯度>99%），由加拿大多伦多儿童医院蛋白中心Greybrothers主任惠赠；鼠IL-18多克隆抗体，24mg，自行制备。兔IgG 24mg、刀豆蛋白Ａ 2g购自美国Sigma公司。 3.动物分组：BABL/c小鼠80只，随机分为5组：正常对照组10只，兔IgG组10只，刀豆蛋白Ａ组20只，IL-18组20只，IL-18抗体组20只。肝纤维化造模参照文献[3]的方法，尾静脉穿刺注射刀豆蛋白A共注射12周，正常对照组注射等量等渗盐水。刀豆蛋白Ａ组，IL-18及IL-18抗体组，尾静脉穿刺注射刀豆蛋白A 10mg/kg，每周1次，IL-18组、IL-18抗体组在尾静脉穿刺注射刀豆蛋白A前2h分别皮下注射IL-18、IL-18抗体15μg/只、100μg/只。IL-18和IL-18抗体剂量的选择根据我们预试验和参考文献[3]。兔IgG组注射兔IgG 100μg/只，其余同上。 4. 血清及肝组织标本采集：（1）采血：各组分别在第12周，注射药物2h后，随机选取8只，眼眶采血法采血，并处死小鼠。血液经1500r/min离心，吸取血清，检测TNFα、IFNγ水平。（2）肝组织标本采集：每只小鼠取一部分肝组织于10%甲醛溶液固定，用于HE、Masson染色，并计算Knodell坏死炎症评分[4]和Ishak纤维化评分[5]。 5. 小鼠血清TNFα、IFNγ水平检测：按照ELISA试剂盒说明书进行。 6. 统计学分析：用SPSS13.0软件做Fisher精确概率法与方差分析。 二、结果 1. 动物一般情况：正常对照组和兔IgG组小鼠无死亡,发育良好，活泼好动。IL-18组死亡7只，动物精神差,活动少，发育迟缓，皮毛松弛，毛色黯淡，厌食，消瘦，体重明显减轻，后期出现大量腹水。刀豆蛋白Ａ组死亡3只，IL-18抗体组死亡1只，动物健康状况相对较好，皮毛柔顺有光泽。IL-18组和IL-18抗体组与刀豆蛋白Ａ组死亡率比较，差异有统计学意义（χ2＝4.56，P<0.05）。 2.肝组织HE染色观察：正常小鼠、兔IgG组12周时肝组织肝小叶结构清晰，肝细胞形态正常（图1A）。刀豆蛋白A组肝组织可见汇管区纤维间隔形成，大量炎症细胞浸润，伴有肝细胞坏死（图1B）。IL-18组小鼠肝组织和刀豆蛋白A组比较，纤维间隔明显增宽、融合，可见大块样坏死（图1C）。IL-18抗体组小鼠肝组织可见较细的纤维条带、细胞脂肪样变，炎症细胞较少浸润（图1D）。 3. 肝组织Masson染色观察: 12周时肝组织Masson染色，正常组、兔IgG组小鼠可见肝小叶结构清晰，肝细胞形态正常。刀豆蛋白A组肝组织可见汇管区纤维间隔形成，大量炎症细胞浸润，伴有肝细胞坏死。和刀豆蛋白A组比较，IL-18组小鼠肝组织纤维间隔明显增宽、融合，假小叶形成，可见大块样坏死。IL-18抗体组小鼠肝组织可见较细的纤维条带，细胞脂肪样变，炎症细胞较少浸润。见图2。 4．小鼠血清TNFα、IFNγ水平：TNFα、IFNγ水平在刀豆蛋白A和IL-18 组明显高于其他组（表1）。 表1 （略） 5. 各组肝组织评分：坏死炎症评分、纤维化评分在刀豆蛋白A和IL-18组明显高于其他组（表2）。 表2 （略） 三、讨论 肝纤维化因慢性炎症致肝脏慢性免疫性损伤的机制仍不明确，主要原因是由于目前没有合适的慢性肝纤维化模型[6]。刀豆蛋白A可引起TNFα和INFγ升高，造成反复的肝损伤与修复，从而诱发肝纤维化[3, 6]。我们用刀豆蛋白A反复注射建立了免疫性肝纤维化模型，并且对形成机制作了探讨。 本实验结果表明IL-18组动物精神差，活动少，发育迟缓，皮毛松弛，毛色黯淡，厌食，消瘦，后期出现大量腹水。肝组织病理学检查显示炎症活动度和肝纤维化评分较其他组明显增加，可见大量碎屑样坏死、桥接样坏死；死亡小鼠可见大块样坏死存在；存活小鼠第4周开始即可见细小纤维条束，至12周就可见大量纤维间隔形成。IL-18抗体组动物健康状况相对较好, 皮毛柔顺有光泽；至实验结束才可见细小纤维条束形成。由此可见，IL-18能加速肝纤维化的形成，而IL-18抗体组肝纤维化的形成明显比模型组慢。对这种结果，我们推测IL-18可能诱导TNFα和IFNγ升高，二者是刀豆蛋白A诱导肝损伤的重要因子[7]；而我们的实验结果也证明了这点。 IL-18和IL-18抗体可以干扰刀豆蛋白A诱导的免疫性肝纤维化，IL-18表现为促进肝纤维化，而IL-18抗体能减轻肝组织的炎症程度、减缓肝纤维化的进程。这与IL-18或IL-18抗体诱导或阻止了TNFα与IFNγ的表达有关。 参 考 文 献 [1]Aizawa Y, Sutoh S, Matsuoka M, et al. Association of interleukin-18 gene single-nucleotide polymorphisms with susceptibility to inflammatory bowel disease. Tissue Antigens, 2005, 65: 88-92. [2]Zhang LH, Pan JP, Yao HP, et al. Intrasplenic transplantation of IL-18 gene-modified hepatocytes: an effective approach to reverse hepatic fibrosis in schistosomiasis through induction of dominant Th1 response. Gene Ther, 2001, 8: 1333-1342. [3]Kimura K, Ando K, Ohnishi H, et al. Immunopathogenesis of hepatic fibrosis in chronic liver injury induced by repeatedly administered concanavalin A. Int Immunol, 1999, 11: 1491-1500. [4]Knodell RG, Ishak KG, Black WC, et al. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepatology, 1981, 1: 431-435. [5]Ishak KG. Pathologic features of chronic hepatitis. A review and update. Am J Clin Pathol, 2000, 113: 40-55. [6]Diao H, Kon S, Iwabuchi K, et al. Osteopontin as a mediator of NKT cell function in T cell-mediated liver diseases. Immunity, 2004,21: 539-550. [7]Okamoto T, Okabe S. Development of anorexia in concanavalin A-induced hepatitis in mice. Int J Mol Med, 2001, 7: 169-172. 中华肝脏病杂志版权 |