【摘要】 目的 通过应用血红素氧合酶（HO）的诱导剂氯高血红素和抑制剂锌原卟啉（ZnPP），探讨HO对大鼠肝脏缺血再灌注（IR）细胞凋亡及其相关基因的影响。 方法 将96只Sprague-Dawley大鼠采用钳夹法制备肝脏IR模型，随机分为假手术组、IR组、氯高血红素组和ZnPP组，检测再灌注0、1.5、4h和8h各个时间点大鼠肝脏功能以及病理学改变，流式细胞法测定肝细胞凋亡率、TUNEL法观察再灌注后4h大鼠肝细胞的凋亡情况，Western blot法检测再灌注后8h Bcl-2和Caspase-3的表达。 结果 在IR组各时间点均可见ALT和AST增高，病理学检查可见肝细胞肿胀，肝窦变窄，嗜中性粒细胞浸润和片状坏死等变化，肝组织中细胞凋亡率明显升高，Bcl-2的表达减少，而Caspase-3的表达增加。在氯高血红素组再灌注后1.5、4h和8h ALT和AST值明显降低，肝脏病理学改善，凋亡细胞减少及细胞凋亡率降低，肝脏Bcl-2的表达增加，Caspase-3的表达减少。ZnPP组则显示与之相反的结果。 结论 HO在肝脏IR损伤中具有保护作用，这种保护作用可能与抑制细胞凋亡有关。
【关键词】 血红素氧合酶； 缺血再灌注； 细胞凋亡； 基因，bcl-2； Caspase-3
Effect of heme oxygenase on apoptosis and apoptosis genes in hepatic ischemia reperfusion injury in rats WANG Yang-yang, FENG Zhi-jie, YUE Yuan-yuan, SONG Mei, SONG Wen-jie. Department of Gastroenterology, Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang, Hebei 050000, China
Corresponding author: FENG Zhi-jie, Email: zhijiefeng2005@ 126.com
【Abstract】 Objective To use heme oxygenase (HO) inducer hemin and a HO inhibitor zinc protoporphyrin (ZnPP) to investigate the effect of HO on apoptosis and apoptosis genes in hepatic ischemia reperfusion (IR) injury in rats. Methods Ninty-six Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups (24 rats in each): a sham-operation group, an ischemia-reperfusion (IR) group, a hemin-IR group and a ZnPP-IR group. Liver functions, liver histology and hepatocellular apoptosis rates were observed at 0, 1.5, 4 and 8 hours after reperfusion. Hepatocellular apoptosis was determined by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling; expressions of Bcl-2 and caspase-3 were determined by Western blot. Results Compared with the sham-operation group, the levels of ALT and AST were increased in the IR group. In the IR group the histological changes found in the livers were swelling of hepatocytes, narrowing of hepatic sinusoids, inflammatory cell infiltration and necrosis of hepatocytes in some areas of the livers. In the IR group rate of hepatocellular apoptosis was increased at 0, 1.5, 4 and 8 hours after reperfusion; expression of Bcl-2 was decreased and the expression of caspase-3 was increased. In the hemin-IR group, the levels of ALT and AST were lower, the pathological changes were milder and the rate of hepatocellular apoptosis was lower at 0, 1.5, 4 and 8 hours in comparison to those of the IR group. The expression of Bcl-2 was higher and the expression of caspase-3 was lower in the hemin-IR group in comparison to those of the IR group. The results in the ZnPP-IR group were just the opposite to those of the hemin-IR group. Conclusion HO might play a protective role in hepatic IR injury in rats, and this effect may be related to the inhibition of hepatocellular apoptosis.
【Key words】 Heme oxygenase; Ischemia reperfusion; Apoptosis; Genes, Bcl-2; Caspase-3
肝脏缺血再灌注（ischemia reperfusion, IR）损伤是由于肝脏组织缺血后，再灌注所引起的肝脏损伤，如肝移植、失血性休克等病理状态下都可引起肝脏IR损伤。肝脏IR损伤发生机制尚不明确，可能与细胞凋亡、活性氧、线粒体损伤和内质网应激等方面有关。血红素氧合酶（heme oxygenase，HO）是血红素降解的起始酶和限速酶，在体内分解血红素生成一氧化碳（carbon monoxide, CO）、胆绿素和自由铁。HO能够发挥抑制细胞凋亡、信号转导等多种生物学效应。细胞凋亡在缺血再灌注损伤方面占有重要作用[1, 2]，但HO是否在肝脏IR损伤中发挥作用，以及与凋亡及其相关基因的关系还不清楚，本研究拟通过应用HO诱导剂氯高血红素和HO抑制剂锌原卟啉（ZnPP），观察HO对肝脏IR细胞凋亡及其相关基因的影响，研究HO对肝脏IR损伤的保护机制，为预防肝脏IR损伤提供理论基础。
材料与方法
1. 材料：生化自动分析仪（购自德国Bayer公司），Epics-XL Ⅱ型流式细胞仪（购自美国Beckman Coulter公司），兔抗Bcl-2多克隆抗体，兔抗Caspase-3多克隆抗体，辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG，兔抗β-actin多克隆抗体及原位细胞凋亡检测试剂盒（购自北京中山生物技术公司产品）。
2. 动物模型的制备：参照Nauta等[3]的方法制备肝脏缺血再灌注模型。10%水合氯醛腹腔注射（0.3ml/kg）麻醉后，取腹部正中切口入腹显露肝脏，显微血管夹夹闭肝中叶和左叶的肝动脉和门静脉，造成70%肝脏缺血模型。钳夹45min后，恢复入肝血流，造成肝脏缺血再灌注模型。
3. 实验分组：将雄性Sprague-Dawley大鼠（由河北医科大学实验动物中心提供）随机分为假手术组（24只）、IR组（24只）、氯高血红素组（24只）和ZnPP组（24只）4组。其中氯高血红素组于手术前12h腹腔内注射氯高血红素（购自美国Sigma公司）20mg/kg；ZnPP组于手术前3h和16h，分2次腹腔内注射ZnPP（购自美国Sigma公司），各10μmol/kg。
4. 病理学和生物化学检查：肝脏组织采用石蜡切片，进行HE染色，观察病理学变化。在再灌注0、1.5、4、8h各个时间点抽取大鼠下腔静脉血，分离血浆，测定ALT和AST。
5. TUNEL法检测凋亡细胞：石蜡切片常规脱蜡脱水，蛋白酶K消化处理，滴加TUNEL反应混合液，湿盒中37℃孵育60min，漂洗后滴加辣根过氧化物酶标记的抗荧光素抗体（POD），湿盒中37℃孵育30min，漂洗，加入DAB，封片。显微镜下观察以细胞核内呈现棕黄色颗粒者为阳性。
6. 流式细胞学方法检测肝细胞凋亡情况：取70%乙醇中保存的肝组织，在120目不锈钢网上研磨制备单细胞悬液，300目钢网过滤，收集细胞悬液，离心、沉淀，溴化乙啶染色30min，应用流式细胞仪检测肝细胞凋亡率。
7. Bcl-2和Caspase-3表达的检测：采用Western blot方法检测，取-70℃保存的肝组织约100mg，匀浆、离心，取上清液测定蛋白质浓度。进行SDS-PAGE。转膜后封闭液封闭过夜，加入适当浓度的第一抗体和第二抗体后，进行电化学发光（ECL）显色，观察Bcl-2和Caspase-3蛋白条带的表达情况。
8. 统计学处理：数据以均数±标准差表示，用SPSS12.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析及q检验。
结 果
1. 大鼠肝脏IR病理学表现：假手术组，肝脏组织形态基本正常。在IR组，可见肝细胞肿胀，肝窦变窄，嗜中性粒细胞浸润和片状坏死区域，肝脏组织结构破坏；氯高血红素组病变较IR组轻，而ZnPP组病变较IR组重（图1）。
2. 血浆ALT和AST结果：IR组与假手术组相比，在再灌注后0、1.5、4h和8h各时间点，均可见ALT和AST增高（P<0.01）。与IR组相比，氯高血红素组在再灌注后1.5、4h和8h，ALT和AST均降低（P<0.05或P<0.01）；而ZnPP组在再灌注后0、1.5、4h和8h，ALT和AST均升高（P<0.01，其中ALT的F值分别为33.65、168.24、166.77、113.89; AST的F值分别为39.83、242.67、188.67、148.38）。
3. TUNEL法检测肝细胞凋亡结果：于再灌注后4h，在假手术组，可见少量肝细胞核被染成棕黄色。IR组，可见大量肝细胞核被染成棕黄色。与IR组相比，氯高血红素组细胞核被黄染的肝细胞数量减少，颜色变淡；ZnPP组被黄染的肝细胞数量增多，颜色加深。
4. 流式细胞学方法检测肝细胞凋亡结果：与假手术组相比，在IR组再灌注后0、1.5、4h和8h，可见细胞凋亡率增高（P<0.01）。与IR组相比，氯高血红素组在再灌注后各时间点凋亡率均下降（P< 0.05或P<0.01）；ZnPP组在再灌注后各时间点细胞凋亡率均升高，F值分别为738.57、43.08、221.87、520.69，P值均<0.01。见图2。
5. Bcl-2和Caspase-3表达：（1）Bcl-2表达：再灌注后8h，相对分子质量为2.6×104的位置上出现一条杂交带，相对分子质量为4.3×104位置上出现内参照β-actin的特异条带。吸光密度（A）值分析结果，与假手术组相比，IR组Bcl-2的A值明显降低（P<0.01）。与IR组相比，氯高血红素组Bcl-2的A值升高（P<0.01）；ZnPP组Bcl-2的A值降低（F＝108.72，P<0.01）。见图3。（2）Caspase-3表达：再灌注后8h，相对分子质量为3.4×104的位置上出现一条杂交带，相对分子质量为4.3×104位置上出现内参照β-actin的特异条带。A值分析结果，与假手术组相比，IR组Caspase-3的A值明显升高（P<0.01）。与IR组相比，氯高血红素组Caspase-3的A值降低（P<0.01）；ZnPP组Caspase-3的A值升高（F＝98.38，P<0.01）。见图4。
讨 论
肝脏IR损伤是常见的临床病理过程，各种原因引起的休克、肝脏手术时钳夹门静脉或肝动脉、肝移植等都可以引起肝脏IR损伤。IR损伤机制是复杂的，涉及细胞凋亡、坏死、氧自由基以及钙超载等方面。细胞凋亡是一种由基因调控的细胞程序性死亡过程。细胞凋亡与IR损伤关系密切。Jiang等[4]认为热缺血再灌注（warm ischemia reperfusion, WIR）导致攻击性的炎症因子和氧自由基的释放，从而引起肝脏的损伤，而细胞凋亡是WIR造成损伤的中心机制。本研究通过TUNEL检测显示，肝脏IR后肝细胞凋亡较假手术组明显增多，同时应用流式细胞学检测方法对各组4个时间点分别测定了其细胞凋亡率，也证实了IR组较假手术组高。
HO是近年发现的在人体多种组织和器官中存在的一种抗氧化酶，它是一种具有催化功能的应激蛋白，催化分解血红素生成CO、胆绿素和自由铁，具有抗细胞凋亡、抗氧化、传导信号和调节免疫等作用。有研究结果表明，HO-CO系统对IR损伤具有保护作用[5-7]，HO-1在IR损伤中是通过其产物CO发挥保护作用的[8]。本研究结果也证实在再灌注后1.5、4h和8h，氯高血红素组ALT和AST均明显降低，而ZnPP组则明显升高。另外，在氯高血红素组，病理学检查发现肝细胞肿胀、变性较IR组有所减轻；而ZnPP组，肝细胞气球样变性明显，肝窦收缩，可见散在的坏死灶，肝细胞索失去正常排列。通过流式细胞学检测细胞凋亡发现，与IR组比较，氯高血红素组各个时间点细胞凋亡率明显下降，而ZnPP组各个时间点细胞凋亡率明显升高。这些结果表明，HO能够减少肝脏IR时的细胞凋亡，从而减轻IR损伤。
Bcl-2是重要的抗细胞凋亡基因，可能通过控制线粒体膜电位丛、调节线粒体膜对凋亡蛋白前体的通透性和固定凋亡蛋白前体在线粒体膜上等作用抑制细胞凋亡。一些实验证实，肝脏IR损伤可以通过增加抗凋亡基因Bcl-2的表达而减轻。Sun等[9]证明通过增加线粒体膜上Bcl-2蛋白的表达，可以减少肝细胞再灌注后的细胞凋亡，对肝脏IR损伤起到保护作用。本研究结果显示，与IR组相比，氯高血红素组Bcl-2表达明显升高，而ZnPP组Bcl-2表达明显降低，结合流式细胞学检测结果，提示HO-CO系统可能通过增加Bcl-2的表达来抑制细胞凋亡，从而减轻大鼠肝脏IR损伤。
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）是细胞凋亡的关键酶。Caspase-3是其家族中重要的一员，其引发细胞凋亡是通过多聚ADP核糖聚合酶（PARP）而实现。Ben-Ari等[10]认为肝脏IR损伤中细胞凋亡的发生与Caspase-3活性密切相关。本研究结果显示，与IR组相比，氯高血红素组Caspase-3表达明显减少，而ZnPP组Caspas-3表达明显增加，说明HO抑制肝脏IR中细胞凋亡的途径可能与Caspase-3有关。近来研究结果显示，HO通过p38有丝分裂原活化的蛋白激酶（p38 MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶/Akt（PI-3K/Akt）途径增加转录激活因子-3（STAT-3）的活性，减弱Caspase-3活性，发挥抗细胞凋亡效应[11]，这将对减轻IR损伤的治疗有重要意义。
参 考 文 献
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