【摘要】 目的 观察二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）抑制核因子-κB（NF-κB）活化后对苦参碱诱导肝癌细胞HepG2凋亡的影响。 方法 MTT法观察苦参碱（分0.8、1.0、1.5、2.0、2.5g/L组）及PDTC联合苦参碱对HepG2细胞增殖的抑制作用。将HepG2细胞随机分为细胞对照组、PDTC组（20μmol/L）、苦参碱组（1.5g/L）和PDTC+苦参碱联合组，流式细胞仪和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法检测细胞凋亡；电泳迁移率改变实验检测细胞核内NF-κB的活化水平。 结果 PDTC增强了苦参碱对细胞增殖的抑制作用（F＝183.92, P＜0.01）。苦参碱同时具有诱导HepG2细胞凋亡和NF-κB活化的作用；PDTC能显著增加苦参碱诱导的HepG2细胞凋亡和抑制苦参碱诱导的HepG2的NF-κB活化，细胞凋亡率由6.11%±0.81%增加至12.95%±0.02%（χ2＝9.67，P＜0.05），NF-κB活化的灰度值由38.82±0.17降至32.01±0.69（χ2＝10.38，P＜0.05）。 结论 苦参碱诱导HepG2细胞凋亡的同时激活NF-κB；PDTC可通过抑制NF-κB活化，增强苦参碱诱导HepG2细胞凋亡的作用。
【关键词】 癌，肝细胞； 细胞凋亡； 核因子-κB； 苦参碱
Inhibition of NF-kappa B activity enhanced apoptosis induced by matrine in hepatocellular carcinoma cells GAO Hang*, HE Song, TANG Wei-xue, WANG Jue. *Department of Gastroenterology, Second Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400010, China
Corresponding author: HE Song, Email: hedoctor65@ sina.com
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between activation of nuclear factor-kappa gene binding (NF-κB) and apoptosis induced by matrine in hepatocellular carcinoma cell line HepG2. Methods HepG2 cells were stimulated by different concentrations of matrine (0.8, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 g/L). The HepG2 cell survival rates were evaluated by MTT assay. Cultured HepG2 cells were implanted in culture flasks and divided into four groups: a control group, a pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) group (20μmol/L), a matrine group (1.5 g/L) and a combination group, PDTC (20μmol/L) + matrine (1.5 g/L) combination group. Apoptosis induced by matrine was analyzed by flow cytometry (FCM) and TUNEL. The DNA-binding activity of NF-κB was determined by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Results PDTC enhanced the inhibition of matrine on cell proliferation (F = 183.92, P < 0.01). The apoptosis and activation of NF-κB of HepG2 cells were induced by matrine. PDTC significantly suppressed NF-κB activation induced by matrine in HepG2 cells. PDTC increased the apoptosis induced by matrine of the HepG2 cells from 6.11%±0.81% to 12.95%±0.02%, χ2 = 9.67, P < 0.01. Conclusions Matrine could induce apoptosis, and at the same time induce activation of NF-κB in HepG2 cells. PDTC increases the apoptosis in hepatocellular carcinoma cells and it may be related to suppressing NF-κB activation of HepG2 cells.
【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Apoptosis; NF- kappa B; Matrine
核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一种存在于多种细胞内，具有多向性调节作用的核转录因子。某些抗癌药物在诱导肿瘤细胞凋亡的同时可活化NF-κB，后者转录调控一系列与细胞存活有关的基因表达，从而阻断细胞凋亡的途径，使肿瘤细胞对化疗药产生耐药性[1]。苦参碱和氧化苦参碱有抗炎、抗病毒及调节免疫等作用[2]，能选择性地抑制肝癌细胞增殖并诱导其凋亡[3, 4]。在苦参碱诱导肝癌细胞凋亡的过程中，是否也同时激活NF-κB；抑制NF-κB活性是否能增加肝癌细胞对苦参碱的敏感性，目前尚无明确结论。我们采用流式细胞仪、末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）和电泳迁移率改变实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）等方法， 观察二硫代氨基甲酸吡咯烷（pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC）抑制NF-κB活化后对苦参碱诱导肝癌细胞HepG2凋亡的影响。
材料与方法
1. 细胞株及培养液：人肝癌细胞株HepG2购自重庆医科大学病毒性肝炎研究所；RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司，新生小牛血清购自杭州四季青公司。
2. 主要试剂及药品：苦参碱注射液10g/L，5ml/支，购自广州明兴制药厂；PDTC、DMSO购自美国Sigma公司；MTT购自北方同正生物制品公司；AnnexinⅤ-FITC试剂盒购自南京凯基生物技术发展有限公司；TUNEL检测试剂盒购自美国Roche公司；T4寡核苷酸激酶购自美国Promega公司；[γ-32P］ATP购自北京市福瑞生物工程公司；NF-κB寡聚核苷酸探针由上海生工生物工程公司合成。
3. MTT法检测：取对数生长期HepG2细胞1×105/ml 200μl种于96孔培养板，每组4个平行孔。待细胞贴壁后弃去培养液给药：苦参碱组加入含苦参碱的培养液200μl，终浓度分别为0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L；联合组用含PDTC（终浓度为20μmol/L）的培养液100μl作用3h后，再加入含苦参碱的培养液100μl，使其终浓度分别为0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L。另设空白对照组（只加培养液200μl）和细胞对照组（只加细胞悬液200μl）。常规培养12h，1000r/min离心10min后弃上清液，每孔加入200μl无血清培养液及20μl MTT，于微量振荡器上振荡2min后继续培养4h。1000r/min离心10min后弃上清液，每孔加入200μl DMSO，振荡5min，自动酶标读数仪测出每孔吸光度值A，波长为570nm。取每组细胞A值的均值，计算：细胞存活率＝实验组平均A值/细胞对照组平均A值×100％。
4．AnnexinⅤ-FITC（碘化丙啶）双标记法检测早期凋亡：取对数生长期HepG2细胞2×105/ml，置于培养瓶中常规培养，待细胞贴壁后弃去培养液加药。单药组分别加PDTC（终浓度为20μmol/L）、苦参碱（终浓度为1.5g/L），作用12h；联用组加PDTC（终浓度为20μmol/L）培养3h后，再加入苦参碱（终浓度为1.5g/L），继续培养12h。另设细胞对照组，培养12h后收集细胞。上流式细胞仪检测，结果以Annexin Ⅴ标记阳性碘化丙啶标记阴性计细胞凋亡率。
5. 原位检测DNA断裂：将对数生长期的HepG2细胞接种至6孔培养板（1×105个/孔），细胞贴壁后，加药处理同上。常规培养12h后取出玻片，PBS洗3次，干燥，用新鲜配置的4%多聚甲醛固定30min，其余按TUNEL检测试剂盒说明书进行。
6. EMSA检测：取对数生长期HepG2细胞，调整浓度为2×105/ml,置于培养瓶中培养，待细胞贴壁后弃去培养液加药。单药组分别加PDTC（终浓度为20μmol/L），苦参碱（终浓度为1.5g/L），作用3h；联合组加PDTC（终浓度为20μmol/L）培养3h后，再加入苦参碱（终浓度为1.5g/L），继续培养3h。另设细胞对照组，培养3h后胰酶消化收集细胞，进行NF-κB活性检测。主要步骤：（1）细胞核蛋白抽提和浓度测定：细胞以冷PBS洗涤2次，置于-20℃，4min。加500μl缓冲液A［10mmol/L HEPES（pH7.9）、1.5mmol/L MgCl2、10mmol/L KCl、0.5mmol/L二硫苏糖醇、0.5mmol/L EDTA、1mmol/L苯甲基磺酰氟］重悬细胞，置冰上孵育15min。加NP-40至终浓度0.5%，4℃ 5000r/min离心30s，弃上清液。加50μl缓冲液B［20mmol/L HEPES（pH7.9）、1.5mmol/L MgCl2、320mmol/L KCl、0.5mmol/L二硫苏糖醇、0.2mmol/L EDTA、1mmol/L苯甲基磺酰氟、20%甘油］轻轻吹打重悬沉淀，置冰上孵育15min。4℃ 12000r/min离心5min，取上清液，-70℃保存。考马斯亮蓝法检测核蛋白的浓度。（2）探针的标记与纯化：探针序列为P1：5′-AGCT TAGAGGGGACTTTCCGAGAGGA-3′，P2：5′-TCCTCTCGGAAAGTCCCCTCTAAGCT-3′（下划线部分为转录因子的识别序列），以[γ-32P]ATP和T4多核苷酸激酶标记制备寡核苷酸探针，制备葡聚糖G-25离心层析柱纯化探针。（3）EMSA测定NF-κB的DNA结合活性: 制备5%的聚丙烯酰胺凝胶, 在0.5ml Eppendorf管中依次加入核提取物5μg、4×缓冲液5μl、poly（dI-dC）1μl，最后加入双蒸水至总体积为20μl；混匀后冰浴15min,加入标记的探针2μl；混匀后室温反应20min，上样，电压200V，电泳2h，放射自显影。用Bio-Rad凝胶成像系统进行胶片扫描，分析结果（灰度面积值）。
7. 统计学分析：实验结果采用SPSS11.0统计软件进行方差分析及Kruskal-Wallis秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果
1. PDTC对苦参碱抑制HepG2细胞生长的影响：在相同浓度下，PDTC与苦参碱联用组对HepG2细胞生长的抑制率明显大于单用苦参碱组，两者比较差异有统计学意义（F＝183.92, P＜0.01），见表1（略）。
2. PDTC对苦参碱诱导HepG2细胞凋亡的影响：苦参碱1.5g/L作用12h即能诱导HepG2细胞凋亡，凋亡率达6.11%±0.81%。20μmol/L PDTC联用苦参碱使其凋亡率增加至12.95%±0.02%，显著增强苦参碱诱导HepG2细胞凋亡的作用。各组HepG2细胞的凋亡率差异有统计学意义（χ2＝9.67, P＜0.05），见表2。
表2 （略）
3．原位检测DNA断裂：显微镜下可见胞核成棕黄色的阳性细胞。与细胞对照组相比，PDTC组凋亡细胞无明显增加，苦参碱组部分细胞的胞核染成棕黄色，凋亡细胞增多，联合用药组凋亡细胞数更多（图1）。
4．PDTC对苦参碱诱导HepG2细胞NF-κB活化的影响：HepG2细胞未经药物诱导时NF-κB也有轻度活化。苦参碱1.5g/L作用3h即可诱导NF-κB活化，单独用PDTC 20μmol/L可显著抑制NF-κB活化。用PDTC 20μmol/L预处理3h后，苦参碱诱导的HepG2细胞NF-κB活化受到明显抑制。细胞对照组和PDTC组、苦参碱组、PDTC+苦参碱组的灰度值分别为24.98±0.20，18.09±0.13，38.82±0.17，32.01±0.69，各组的灰度值差异有统计学意义，χ2＝10.38, P＜0.05（图2）。
讨 论
NF-κB可以调节多种基因的转录激活，这些基因的转录激活与细胞增殖、血管发生、肿瘤转移和细胞凋亡的抑制作用密切相关，是NF-κB促进肿瘤生长和肿瘤细胞耐药的中心环节,抑制NF-κB活性能增加肿瘤细胞对化疗药物和放疗的敏感性[5, 6]。
本研究结果显示：苦参碱对HepG2细胞的生长有明显抑制作用。与单用苦参碱相比，PDTC能够增强各浓度组苦参碱抑制细胞增殖的作用，且低浓度组（0.8、1.0、1.5g/L）抑制率增加明显。
Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一，与鉴定细胞死活的核酸染料碘化丙啶合并使用，可以有效区分凋亡细胞与死亡细胞，常用于检测细胞的早期凋亡，并可定量分析。本研究中，1.5g/L苦参碱与HepG2细胞作用12h即可引起凋亡，先以PDTC作用然后加入苦参碱能显著增强苦参碱诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的作用。通过细胞形态学观察也发现PDTC组与对照组相比，凋亡细胞数差异不明显，苦参碱组部分细胞的胞核染成棕黄色，凋亡细胞增多，联合用药组凋亡细胞数更多。均表明苦参碱在体外能诱导肝癌细胞凋亡，PDTC能显著增强苦参碱诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的作用。本研究结果还显示：1.5g/L苦参碱作用3h后，HepG2细胞中NF-κB活化水平即有升高，PDTC可以明显抑制苦参碱诱导NF-κB的活化。因此推测苦参碱诱导NF-κB活化可能是造成肝癌细胞对苦参碱早期耐药的原因之一，通过PDTC减少NF-κB活化，抑制NF-κB的抗凋亡作用，可增加癌细胞对苦参碱的敏感性。提示在肝癌治疗过程中，先抑制NF-κB活性，然后使用低浓度的苦参碱，可能取得良好的抗癌效果，同时大大减少苦参碱的不良反应，这对临床治疗有重要的指导意义。此外，我们的实验结果还显示，HepG2细胞在无苦参碱作用时，NF-κB亦有一定程度的活化，推测长期体外传代培养的肝癌细胞株 HepG2处于持续活化状态，可能与肿瘤细胞的永生化有关。
参 考 文 献
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陆伦根,曾民德,茅益民,等.氧化苦参碱治疗慢性乙型肝炎的随机双盲对照多中心研究.中华肝脏病杂志,2004,12:597-600.
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司维柯,潘静,陆华,等.苦参碱抑制HepG2细胞增殖及其剂量与抑制方式关系的研究.世界华人消化杂志,2001,9:185-189.
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中华肝脏病杂志版权
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