【摘要】 目的 检测HCC患者血浆循环DNA杂合性缺失（LOH），并探讨将其作为有关临床预测标记的可能性。 方法 选择位于染色体8p上3个具有高度多态性的微卫星标记D8S277、D8S298和D8S1771，对62份HCC患者血浆循环DNA进行LOH检测，并进一步探讨LOH与患者HBsAg表达、是否肝硬化、血清AFP水平、肿瘤大小及细胞分化程度和有无肝内转移等临床病理特征之间的关系。 结果 在62份HCC患者血浆循环DNA标本中，36份（58.1%）在1个或多个位点发生LOH，D8S277、D8S298和D8S1771位点杂合度分别为74.2%（46/62）、75.8%（47/62）和69.4%（43/62），LOH频率分别为32.6%（15/46）、44.7%（21/47）和46.5%（20/43）。D8S298位点有肝内转移患者血浆循环DNA标本的LOH频率（62.5%）明显高于无肝内转移者（26.1%），差异有统计学意义（P<0.05）；其他临床病理特征与3个位点上的LOH频率无明显相关。 结论 血浆循环DNA中D8S298位点LOH有可能成为HCC术后转移复发及预后的一个潜在的预测标记。
【关键词】 癌，肝细胞； 血浆； 循环DNA； 杂合性缺失
Loss of heterozygosity of plasma circulating DNA from hepatocellular carcinoma patients and its clinical significance PANG Jin-zhong*, QIN Lun-xiu, WANG Qiang-qing, REN Ning, SUN Bing-sheng, LIN Guo-ling, YE Qing-hai, LIU Yin-kun, TANG Zhao-you. *Department of General Surgery, First People’s Hospital of Qingdao Economic and Technical Development Zone, Qingdao 266555, China
Corresponding author: TANG Zhao-you, Email: zytang@ srcap.stc.sh.cn. Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China
【Abstract】 Objectives To detect the loss of heterozygosity (LOH) of circulating DNA in the plasma of patients with hepatocellular carcinoma (HCC), and to assess its potential as a clinical predictive marker. Methods Three high-polymorphic microsatellite markers D8S277, D8S298 and D8S1771 located at chromosome 8p were selected to detect LOH in plasma DNA of 62 HCC patients. The associations between LOH and its clinicopathological features, including HBsAg, liver cirrhosis, serum AFP level, tumor size, tumor cell differentiation, and intrahepatic metastasis were also examined. Results In plasma DNA of the 62 HCC patients, LOH was found at one or several loci in 36 (58.1%), and heterozygosity at D8S277, D8S298, and D8S1771 loci was 74.2% (46/62), 75.8% (47/62), and 69.4% (43/62), respectively. LOH frequency at D8S277, D8S298 and D8S1771 was 32.6% (15/46), 44.7% (21/47), and 46.5% (20/43), respectively. LOH in plasma DNA was more frequently detected in the patients with intrahepatic cancer metastasis than those without metastasis (62.5 percent vs. 26.1 percent, P < 0.05); however, no statistically significant correlations were observed between LOH at these loci and other clinicopathological features analyzed in this study. Conclusions LOH at D8S298 in plasma DNA may be a potential predictive marker of intrahepatic metastatic recurrence after surgical resection of the HCC.
【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Plasma; Circulating DNA; Loss of heterozygosity
近年来，越来越多的研究表明，恶性肿瘤患者血浆循环DNA具有肿瘤DNA的特征性改变，因此肿瘤血浆循环DNA的定性检测，如基因突变、抑癌基因的甲基化及杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）等，已经成为肿瘤分子生物学研究的新热点，并对肿瘤的分子诊断、治疗、预后评估等方面具有重要的临床意义[1]。本研究中我们选用染色体8p上3个具有高度多态性的微卫星位点，对62例HCC患者的血浆循环DNA进行LOH检测，并就它作为有关临床预测标记的可能性进行探讨。
材料与方法
1．标本收集：收集复旦大学附属中山医院肝外科2004年10月-2005年1月手术治疗并经病理证实的62例HCC患者外周血标本。抗凝外周血（5ml）在手术前取自患者的肘静脉，3000r/min离心20min，收集上层血浆2ml，余血经淋巴细胞分离液（购自挪威Lymphoprep公司）密度梯度离心法获得淋巴细胞，血浆和淋巴细胞－70℃贮存备用。另外收集20例代偿期肝硬化患者及20例健康志愿者外周血作为正常对照，所有患者及对照者均排除糖尿病、系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。
2．血浆标本DNA抽提：血浆循环DNA的抽提严格按照QIAamp DNA Blood Midi试剂盒（购自德国Qiagen公司）的操作步骤进行，每2ml血浆获得300μl DNA。外周血淋巴细胞DNA经Genomic DNA Purification试剂盒（购自上海申能博彩公司）抽提作为正常对照。上述提取的DNA均经紫外分光光度计定量后-20℃贮存备用。
3．引物合成及PCR反应：选择染色体8p上3个微卫星位点D8S277、D8S298和D8S1771，其引物序列均根据GenBank检索确定，并由上海生工生物工程公司合成，上游引物5′端标记荧光染料FAM、HEX或NED。PCR总反应体积15μl，10×PCR缓冲液1.5μl，25mmol/L MgCl2 1.5μl，10mmol/L dNTP 1.5μl，上、下游引物各5pmol，基因组DNA 100ng，AmpliTaq Gold DNA聚合酶0.12μl。反应在GeneAmp PCR System 9700热循环仪（购自美国ABI公司）上进行，反应条件：95℃ 12min；94℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 30s，10个循环；89℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。
4. LOH的检测：将血浆、淋巴细胞经PCR扩增的产物置于PRISM 3700 DNA测序仪（购自美国ABI公司）电泳，并用ABI专用分析软件包（Genescan Version 3.0和Genotyper Version 3.7）对结果进行分析处理。在HCC患者外周血淋巴细胞DNA中，当一个位点的基因型表现为两个不同大小的片段PCR产物峰时定义为杂合子，定为有信息标本；当一个位点的基因型表现为单个PCR产物峰时定义为纯合子，为无信息标本，予以剔除。有信息标本中，血浆DNA两条等位基因波峰比值/淋巴细胞DNA中相应等位基因波峰比值结果在0.67～1.50为无LOH，<0.67或>1.5即判为LOH。异常病例需经再次PCR、电泳证实。计算杂合度（有信息标本份数/标本总数）及LOH频率（LOH份数/有信息标本份数）。
5. 统计学处理：采用SPSS11.5统计软件分析，LOH与临床病理特征之间的关系用Chi-Square检验。
结 果
1. 一般资料：62例患者中男57例，女5例；年龄32～80岁，平均51.9岁；AFP≥20μg/L 46例、HBsAg阳性57例、伴有肝硬化50例；肿瘤直径1～14cm，平均5.6cm；32例有肝内转移，包括肝内播散灶和脉管内癌栓。
2. 3个位点在血浆循环DNA中的LOH频率：62份HCC血浆循环DNA标本中，36份（58.1%）至少有1个位点出现LOH，在这36份血浆标本中，18份（50%）仅在1个位点显示LOH，16份（44.4%）在2个位点显示LOH，2份（5.6%）在3个位点均有LOH。D8S277、D8S298和D8S1771 3个微卫星位点的杂合度都较高，分别为74.2%（46/62）、75.8%（47/62）和69.4%（43/62）。3个位点中D8S1771位点LOH频率最高，为46.5%（20/43），其次为D8S298（44.7%，21/47）和D8S277（32.6%，15/46）。见表1（略）。20例代偿期肝硬化患者及20例健康志愿者的血浆DNA在任一位点均未检测到LOH。
3． HCC血浆循环DNA杂合性缺失与临床病理特征之间的关系：在D8S298位点，24份有肝内转移标本血浆循环DNA的LOH频率为62.5%（15/24），23份无肝内转移标本LOH频率为26.1%（6/23），二者差别有统计学意义（χ2＝6.300，P＜0.05）。其他临床病理特征，如患者HBsAg表达、是否肝硬化、血清AFP水平、肿瘤大小及细胞分化程度等与3个位点上的LOH频率皆无明显相关（P值均>0.05）。见表2（略）。
讨 论
循环DNA是一种无细胞状态的胞外DNA，存在于血液（血清或血浆）、滑膜液等体液中，在证明DNA的双螺旋结构之前，就在患者和健康人群的血浆中检测到了它的存在。直到1977年Leon等[2]首先报道肿瘤患者血浆DNA水平远高于正常人后，肿瘤循环DNA的检测才逐渐受到人们的重视，并在乳腺癌、胰腺癌、肺癌等肿瘤患者外周血循环DNA中检测到了与原发肿瘤灶一致的分子生物学特性，如p53基因突变、K-ras基因突变、p16INK4ａ基因过甲基化以及基因微卫星改变等。在HCC患者的血浆循环DNA中，许多学者也检测到了上述肿瘤DNA的一些特征性改变[3, 4]。我们以往研究发现，HCC血浆循环DNA与肿瘤组织微卫星变异有较高的一致性，血浆循环DNA可以用来反映肿瘤组织的微卫星变异，其中包括LOH[1]。由此表明，HCC患者血浆中循环DNA主要来自于肿瘤原发灶的肿瘤细胞，HCC原发灶中肿瘤基因特异性改变可以通过血浆中的循环DNA检测到，为血浆循环DNA成为HCC基础及临床研究的新靶点奠定了坚实的理论基础。
近年来，外周血生物学指标的检测由于简便易行、临床实用性强，已被人们逐渐应用于临床肿瘤的早期诊断、预后预测及跟踪随访等方面。染色体LOH作为基因组不稳定的一个重要分子标志，在HCC等肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。Qin等[5]用比较基因组杂交方法研究肝癌原发灶和转移灶病理标本，发现染色体8p缺失与肝癌转移密切相关，并在对肝癌转移模型和细胞系的研究中得到证实[6]，这就为血浆循环DNA染色体8p上的LOH成为肝癌术后转移复发的潜在预测标记提供了可能。因此在本研究中，我们对8p上3个具有高度多态性的微卫星标记作了LOH检测，发现62份HCC血浆循环DNA中，共有36份（58.1%）至少有1个位点发生LOH，其中D8S1771位点LOH频率最高，为46.5%，其次为D8S298（44.7%）和D8S277（32.6%）。在与临床病理特征的联系中，发现血浆循环DNA中D8S298位点LOH与肝内转移（包括肝内播散灶和脉管内癌栓）密切相关，表明血浆DS8298位点LOH有可能作为一个高转移侵袭特性的分子标记。肝癌手术切除后的复发，尤其是转移性的复发仍是目前影响肝癌患者术后生存率提高的主要障碍，而伴有肝内转移的患者，由于其高转移侵袭的能力，术后转移复发的几率将会明显高于不伴有肝内转移的患者。因此，术前血浆循环DNA在D8S298位点的LOH有可能成为肝癌术后转移复发潜在的预测标记，这将有助于HCC患者术前、术后选择更加合理的个体化的治疗方案，具有重要的临床意义。另外，Chang等[7]认为血浆DNA的LOH分析可作为HCC的一种早期诊断方法，用于高危人群的筛查，可查出AFP值正常的临床前期的小肝癌，尤其是AFP值低于参考范围的病例。同样在其它肿瘤，如黑色素瘤[8]、乳腺癌[9]等，亦发现血浆循环DNA的LOH可以作为预测肿瘤患者预后的分子标记。相信随着分子生物学检测技术的快速发展，外周血肿瘤标记有望逐步替代受到标本采集以及无法连续检测和随访追踪等诸多限制的组织学肿瘤标记。
另外，国际抗癌联盟在2002年制定的第6版肝癌TNM分期标准中，肿瘤大小因素的作用被弱化，而能更好反映肿瘤生物学特性即恶性程度（转移侵袭能力）的指标，如血管侵犯（包括大血管侵犯和微血管侵犯）、多发肿瘤（反映肝内播散）成为分期系统的主要依据，说明二者已成为肝癌预后评价最重要的因素。因此，血浆中与肝内转移密切相关的D8S298位点LOH，作为高转移侵袭能力的一个潜在分子标记，可能有助于HCC的预后预测。在本研究中由于病例数尚少，病例主要集中在TNM分期的Ⅰ、Ⅱ期（共49例），而Ⅲb、Ⅲc期病例太少，只有3例，无Ⅳ期病例，所以没有对TNM分期与血浆DNA杂合性缺失之间的关系进行分析，这还需要进一步扩大样本数进行研究，目前这项工作正在进行中。新制订的肝癌TNM分期同样具有内在的缺陷，但让我们看到了分期的发展方向。有专家预言，寻找能更好地反应肝癌生物学特性的某些分子作为预后指标用于建立肝癌的分子分期，是今后的一个主要努力方向。
参 考 文 献
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逄锦忠,钦伦秀,任宁,等.肝细胞癌患者血浆循环DNA微卫星变异的研究.中华医学杂志,2006,86:1662-1665.
[2]Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res, 1977, 37: 646-650.
[3]Wong IH, Zhang J, Lai PB, et al. Quantitative analysis of tumor-derived methylated p16INK4a sequences in plasma, serum, and blood cells of hepatocellular carcinoma patients. Clin Cancer Res, 2003, 9: 1047-1052.
[4]Szyma駍ka K, Lesi OA, Kirk GD, et al. Ser-249TP53 mutation in tumour and plasma DNA of hepatocellular carcinoma patients from a high incidence area in the Gambia, West Africa. Int J Cancer, 2004, 110: 374-379.
[5]Qin LX, Tang ZY, Sham JS, et al. The association of chromosome 8p deletion and tumor metastasis in human hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 1999, 59: 5662-5665.
[6]Qin LX, Tang ZY, Ye SL, et al. Chromosome 8p deletion is associated with metastasis of human hepatocellular carcinoma when high and low metastatic models are compared. J Cancer Res Clin Oncol, 2001, 127: 482-488.
[7]Chang YC, Ho CL, Chen HH, et al. Molecular diagnosis of primary liver cancer by microsatellite DNA analysis in the serum. Br J Cancer, 2002, 87: 1449-1453.
[8]Taback B, Fujiwara Y, Wang HJ, et al. Prognostic significance of circulating microsatellite markers in the plasma of melanoma patients. Cancer Res, 2001, 61: 5723-5726.
[9]Silva JM, Silva J, Sanchez A, et al. Tumor DNA in plasma at diagnosis of breast cancer patients is a valuable predictor of disease-free survival. Clin Cancer Res, 2002, 8: 3761-3766. 中华肝脏病杂志版权 |
