【摘要】 目的 探讨蛋白激酶C（PKC）活性改变对HSC表达TGFβ1的影响及在HSC激活中的作用。 方法 将肝星状细胞系rHSC-99分为3组：对照组（A组），PKC激动剂佛波酯0.5μmol/L组（B组），PKC抑制剂Calphostin C 100nmol/L组（C组）。加药后0、3、6、12h和24h分别检测各组细胞PKC活性的变化；作用24h后，采用Western blot和RT-PCR方法检测各组细胞TGFβ1，Smad 4，Ⅰ、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的表达；采用MTT法检测细胞的增殖情况。 结果 佛波酯作用后PKC的活性显著增强，而Calphostin C则抑制PKC的活性。PKC活性增强后，与对照组相比TGFβ1及其下游信号分子Smad 4的表达分别升高了4.8倍和13.1倍（P<0.01）；HSC的Ⅰ、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白的表达分别升高了2.4倍、1.8倍和1.3倍（P<0.01），并促进HSC的增殖；PKC活性被抑制后则能抑制以上作用。 结论 PKC活性的改变能调控HSC中TGFβ1的表达，在HSC的激活中发挥调节作用。
【关键词】 转化生长因子β； 蛋白激酶C； 肝星状细胞
Effect of protein kinase C/transforming growth factor beta 1 pathway on activation of hepatic stellate cells LI Tao, LENG Xi-sheng, ZHU Ji-ye, GUO Yan-tong, WEI Yu-hua. Department of Hepatobiliary Surgery, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China
Email: ltlitao@ hotmail.com
【Abstract】 Objective To investigate the effect of protein kinase C (PKC)/transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) pathway on activation of hepatic stellate cells (HSC). Methods HSC rHSC-99 cell line was used in three groups in this study. Group A served as a control. In group B the HSC were incubated with PKC agonist PMA (0.5μmol/L), and in group C the cells were incubated with PKC inhibitor calphostin C (100 nmol/L). The PKC activities were detected at different incubation time points (0, 3, 6, 12 and 24 h). Western blot and RT-PCR were used to detect the expression of TGFβ1, Smad 4, collagen type I, III and α-smooth muscle actin (α-SMA) at the 24 h point. Cell proliferation was assessed by MTT colorimetric assay. Results PMA increased the activity of PKC significantly, whereas calphostin C inhibited the activity of PKC. The increased activity of PKC promoted the HSC to express TGFβ1, Smad 4, collagen type I, III and α-SMA. In comparison with the controls, the expressions of TGFβ1, Smad 4, collagen type I, III and α-SMA increased 4.8, 13.1, 2.4, 1.8 and 1.3 fold respectively (P < 0.01). PKC promoted the proliferation of HSC. The above effects were inhibited by the inhibition of PKC activity. Conclusion Changing of PKC activity can regulate and control the expression of TGFβ1, which may play a role in regulating the activation of HSC.
【Key words】 Transforming growth factor beta; Protein kinase C; Hepatic stellate cell
研究表明，HSC的持续激活是肝硬化发生发展过程中的核心环节。因此，研究HSC激活的调控机制，对于揭示肝硬化、门静脉高压症的发病机制和探索以HSC为靶向的治疗新途径都具有重要的意义。HSC的激活过程十分复杂，是多种细胞因子的旁分泌和自分泌协同作用的结果。其中TGFβ1是最强大的促进HSC合成细胞外基质和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的细胞因子[1]。在HSC激活的信号通路中起着关键性的作用。HSC中如何调控TGFβ1的表达？研究发现，在肾小球系膜细胞（mesangial cell, MC）中蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）活性的改变可以调控TGFβ1的表达。本研究旨在探讨HSC中是否也存在经PKC来调控TGFβ1的表达，PKC活性的改变能否调控HSC的激活。
材料与方法
1. 细胞系：自行建立肝星状细胞系rHSC-99[2]。
2. 主要试剂：PKC激动剂佛波酯（phorbol myristate acetate, PMA）、PKC拮抗剂（Calphostin C）购自美国Sigma公司；PepTag蛋白激酶C活性检测试剂盒购自美国Promega公司。兔抗鼠TGFβ1多克隆抗体、兔抗鼠Smad 4多克隆抗体，购自武汉博士德公司；鼠抗人Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原多克隆抗体，购自美国Oncogene公司；鼠抗人α-SMA单克隆抗体，购自丹麦Dako公司；TGFβ1引物及内参照β-actin自行设计，均由上海生工生物工程公司合成：TGFβ1（146bp）：上游5′-TGAGTGGCTG TCTTTTGACG-3′，下游5′-TGGGACTGATCC CATTGATT-3′；β-actin（523bp）：上游5′-TGGG ACGATATGGAGAAGAT-3′，下游5′-ATTGCC GATAGTGATGACCT-3′。
3. 实验分组：选生长状态良好、处于对数生长期的第60代的rHSC-99细胞，以5×104个/ml的浓度接种于6孔板中培养。待细胞融合生长后，换含胎牛血清体积分数为1%的DMEM过夜，然后再换为含胎牛血清体积分数为10%的DMEM。将细胞分为以下3组：对照组（A组）：加PBS。PKC激动剂组（B组）：加入PMA终浓度为0.5μmol/L。PKC抑制剂组（C组）：加入PKC拮抗剂终浓度为100nmol/L。加药后0、3、6、12h和24h分别进行蛋白激酶活性检测，药物作用24h后，分别提取细胞总蛋白和总RNA，Western blot和RT-PCR检测。
4. 蛋白激酶活性检测：常规RIPA裂解液提取细胞总蛋白并采用Bradford法测定总蛋白的浓度。采用PepTag蛋白激酶C活性检测试剂盒来检测PKC的活性并进行定量分析。
5. Western blot检测TGFβ1、Smad 4、Ⅰ与Ⅲ型胶原和α-SMA表达：各组蛋白标本30μl（总蛋白浓度为1μg/μl）电泳后转移至硝酸纤维素膜上。将硝酸纤维素膜放入杂交袋中，以0.1ml/cm2的量加入封闭液。4℃封闭过夜。次日加入1∶1000稀释的第一抗体，室温杂交2h。洗膜后加入1∶2000稀释的第二抗体，室温1h。洗膜后采用电化学发光法检测，在暗室中用X光胶片曝光并冲洗显影。X光胶片行图像分析，测定条带灰度值。
6. RT-PCR检测各组TGFβ1 mRNA的表达：采用Trizol试剂提取细胞总RNA。取5μg RNA进行cDNA的合成，采用20μl反应体系合成cDNA。PCR扩增TGFβ1。同一标本扩增β-actin作为内参照。PCR反应采用25μl体系，其中含：5μl cDNA、200pmol上下游引物、200μmol 4种dNTP、2.5μl 10×PCR缓冲液, 2.5U Taq酶，1.5mmol/L MgCl2，反应条件为预变性94℃ 2min，94℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 50s；30个循环后再72℃延伸10min。PCR产物25g/L琼脂糖凝胶电泳（含50mg/L溴化乙锭），75V，1h后在紫外灯下观察结果并摄相。相片行图像分析，测定灰度值。用TGFβ1/β-actin的灰度值比来表示TGFβ1 mRNA的相对表达量。
7．MTT法检测PKC活性改变后对HSC增殖的作用：取96孔板，每孔加入100μl细胞悬液（1×104/ml），37℃，体积分数5% CO2孵育箱中过夜；细胞同步化：灭菌PBS洗3遍细胞后加入无血清培养基继续培养16～24h；空白对照组加无血清培养基；PKC激动剂组加入PMA终浓度为0.5μmol/L；PKC抑制剂组加入Calphostin C终浓度为100nmol/L。37℃，体积分数5% CO2孵育箱中继续培养48h；每孔中加入5mg/ml的MTT 40μl，终浓度0.1mg/ml，在同样条件下继续培养4h；弃去培养液，每孔加入等体积的DMSO，充分溶解代谢产物，酶标仪测定540 nm吸光度值。
8．统计学处理：数据以x-±s表示，用组间t检验。采用SPSS10.0软件分析，P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
1. PKC活性的变化：PKC作用于底物后，磷酸化的底物向正极泳动，而未磷酸化的底物向负极泳动（图1略）。0.5μmol/L的PMA作用3、6、12h和24h后，HSC的PKC活性显著增强（图2略）。而100nmol/L的Calphostin C作用后PKC活性被抑制（图3略）。
2. PKC活性改变后TGFβ1和Smad 4表达的变化：各组加药后24h，TGFβ1和Smad 4表达的变化见表1。PKC活性增强后能上调肝星状细胞TGFβ1的mRNA和蛋白的表达，并能上调TGFβ1下游信号分子Smad 4的蛋白表达；PKC活性抑制后则TGFβ1的mRNA和蛋白表达降低。但Smad 4的表达没有明显的下降。
3. Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的变化：各组Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的变化见表2（略）。PKC活性增强后明显促进HSC的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达，PKC活性抑制则表达降低。
4.Western blot检测α-SMA表达的变化：各组α-SMA表达的变化见表3（略）。PKC活性增强后HSC的α-SMA表达明显增强，PKC活性被抑制后α-SMA的表达下降。
5. MTT法检测细胞的增殖：PKC活性增强后明显促进HSC的增殖，PKC活性被抑制后细胞的增殖也被抑制，见表4（略）。
讨 论
研究调控TGFβ1信号传导的机制有助于阐明HSC激活的调控机制，对于揭示肝硬化、门静脉高压症的发病机制和探索以HSC为靶向的治疗新途径都具有重要意义。
目前关于PKC的活性检测方法，文献多采用同位素标记的底物与PKC作用的方法来检测。我们采用的PKC活性检测方法是一种非同位素、简便快捷的方法，可以达到和同位素方法一样敏感的结果。其原理是：采用能与PKC高度特异性结合的荧光多肽底物。多肽底物被PKC磷酸化后其净电荷由+1改变为-1。因此反应后底物进行琼脂糖电泳就可以将磷酸化和非磷酸化的多肽分开。磷酸化的底物多肽向正极泳动而非磷酸化的底物向负极泳动。检测磷酸化底物的荧光含量即可得出PKC的相对活性。此方法可以用来检测小于10ng的PKC。我们的检测结果表明，PMA作用后HSC中PKC的活性显著增强，而Calphostin C作用后HSC的PKC活性被抑制。
有研究发现，在MC中PKC能调控TGFβ1的表达。增强MC中PKC的活性，能促进MC表达TGFβ1，并使MC分泌胶原增多；抑制PKC活性则使MC合成TGFβ1减少、分泌细胞外基质减少[3，4]。此外，还有学者报道，在小鼠的上皮细胞中PKC的激动剂PMA能促进TGFβ1的表达[5]。在大鼠的血管平滑肌细胞，激活的PKC能促进TGFβ1的表达。MC和HSC在组织来源和细胞功能上很相似，而且MC在肾小球硬化症的作用和HSC在肝纤维化中的作用也极其相似。因此，理论上完全存在PKC调控HSC中TGFβ1表达的可能性。本研究结果显示，PKC活性增强后能显著上调HSC中TGFβ1 mRNA和蛋白的表达，并能上调TGFβ1下游信号分子Smad 4的蛋白表达；PKC活性被抑制后，TGFβ1 mRNA和蛋白表达降低。这些结果提示：在HSC中，PKC活性的改变能调控TGFβ1及其下游信号分子的表达。但Calphostin C对Smad 4的抑制作用不明显。Calphostin C是作用于PKC调节区的抑制剂，与Ca2+、磷脂、二脂酸甘油酯或PMA相结合发挥作用，因此对PKC的作用有较高的选择性，而作用于PKC催化区的抑制剂可以和PKC的保守残基结合而对PKC的作用没有选择性[6]。因此，是否有其他作用于PKC催化区的抑制剂能抑制Smad 4的表达，有待于进一步研究。
表达α-SMA是HSC被激活的标志[1，7]。因此我们检测HSC的α-SMA表达研究PKC活性改变对HSC激活的影响。结果表明PKC活性增强后，HSC的α-SMA表达明显增强，PKC活性被抑制后α-SMA的表达下降。Ramm等[8]也发现PKC的激动剂能促进HSC表达α-SMA而PKC的抑制剂则能抑制α-SMA的表达。由于TGFβ1是最强大的促进HSC表达α-SMA和激活的细胞因子，我们的研究结果表明PKC能调控HSC的TGFβ1表达。这提示PKC可能是通过TGFβ1信号通路对HSC的激活起调控作用。
激活的HSC大量增殖、细胞外基质生成增多。TGFβ1是目前已知最强大的促进HSC分泌细胞外基质的细胞因子。能促进HSC合成Ⅰ、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、层黏连蛋白等细胞外基质。TGFβ1还能通过增强HSC中血小板衍生生长因子的表达促进其增殖。本研究发现PKC活性增强后HSC的增殖速度加快，进入指数增长期的时间缩短；而且HSC的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达升高。抑制PKC活性则抑制这些作用。这表明PKC能通过TGFβ1通路影响HSC增殖和分泌细胞外基质的功能。
参 考 文 献
[1]Gressner AM, Weiskirchen R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med, 2006, 10: 76-99.
[2]Leng XS, Weng SG, Li T, et al. Establishment of a new rat hepatic stellate cell line rHSC-99 with characteristics of myofibroblast cells. Jiepou Xuebao, 2003, 34: 269-274.
冷希圣,翁山耕,李涛,等.大鼠肝星状细胞系的建立及其生物学特性的研究. 解剖学报,2003,34:269-274.
[3]Kasho M, Sakai M, Sasahara T, et al. Serotonin enhances the production of type IV collagen by human mesangial cells. Kidney Int, 1998, 54: 1083-1092.
[4]Studer RK, DeRubertis FR, Craven PA. Nitric oxide suppresses increases in mesangial cell protein kinase C, transforming growth factor beta, and fibronectin synthesis induced by thromboxane. J Am Soc Nephrol, 1996, 7: 999-1005.
[5]Akhurst RJ, Fee F, Balmain A. Localized production of TGF-beta mRNA in tumour promoter-stimulated mouse epidermis. Nature, 1988, 331: 363-365.
[6]Nishizuka Y. The role of protein kinase C in cell surface signal transduction and tumour promotion. Nature, 1984, 308: 693-698.
[7]Reynaert H, Thompson MG, Thomas T, et al. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut, 2002, 50: 571-581.
[8]Ramm GA, Li L, Britton RS, et al. Effect of protein kinase C activation and inhibition on rat hepatic stellate cell activation. Dig Dis Sci, 2003, 48: 790-796.
中华肝脏病杂志版权 |
