【关键词】 癌，肝细胞； 细胞凋亡； X染色体连锁凋亡抑制蛋白 Apoptosis of HepG2 cells induced by shRNA targeting X-linked inhibitor of apoptosis protein gene WU Xiao-li, ZHANG Peng, ZHANG Qiong, LI Pei-yuan, LIN Ju-sheng. 【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Apoptosis; X-linked inhibitor of apoptosis protein 【First author address】 Department of Gastroenterology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong Universtity of Science and Technology, Wuhan 430030, China Corresponding author: LIN Ju-sheng, Email:jslin@ tjh.tjmu.edu.cn X染色体连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）是凋亡抑制蛋白家族中最具有caspase抑制能力的成员，具有较强的抗凋亡能力[1]。有研究表明XIAP在肿瘤中高表达可能是肿瘤进展及导致肿瘤对化疗药物耐药的一个重要机制[2]。我们通过构建以XIAP为靶的短发夹状RNA（shRNA）重组质粒，观察下调XIAP表达对HepG2细胞生长及凋亡的影响。 一、材料与方法 1. 材料及其来源：人肝癌细胞株HepG2购自美国典藏物培养中心。psiRNA-hH1neo购自美国Invitrogen公司。目的基因引物和内参照引物均由上海生工生物工程公司合成。DMEM、新生牛血清购自美国Gibco公司，T4 DNA连接酶、限制性内切酶Bbs1购自美国NEB公司，限制性内切酶Ase购自美国MBI Fermentas公司。脂质体DNA-metafectene购自德国Biontex公司。鼠抗人XIAP单克隆抗体和兔抗人β-肌动蛋白单克隆抗体购自加拿大Stressgen公司，其相应第二抗体购自北京中山公司。质粒抽提纯化试剂盒购自中国博大泰克公司。AnnexinV-PI试剂盒购自美国Bender公司。 2. 细胞培养：实验细胞株及其对照细胞株生长于含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。 3. 真核表达载体psiRNA-hH1neo-XIAP质粒的构建：在PubMed基因库中查出XIAP的完整基因序列（序列编号U45880），设计并合成针对XIAP的shRNA。序列见表1。将合成含BbsⅠ酶切位点的寡核苷酸链用T4 DNA连接酶插入到psiRNA-hH1neo质粒的两个BbsⅠ位点之间。重组质粒转化后通过蓝白斑筛选挑取阳性克隆，扩增后抽提质粒，进行酶切与测序法鉴定（由上海生工生物工程公司完成）。 4. 重组质粒的转染和XIAP基因表达：HepG2细胞种于6孔板及96孔板内，按照质粒∶脂质体比例为1∶6（μg∶μl）逐滴加入脂质体DNA-metafectene及质粒复合物转染细胞，重组质粒为实验组，空载体为对照组。细胞转染48h后收集细胞提取总RNA，PCR检测XIAP基因的表达。分别设计XIAP基因和β-肌动蛋白的PCR引物并合成：XIAP基因正义链：5′-TGGTCAGAACACAGGCGACA-3′，反义链：5′-CCCTCCTCCACAGTGAAAGC-3′，产物长度为270bp。β-肌动蛋白正义链：5′-CTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，反义链：5′-CTTTAGCACGCACTGTAATTCCTC-3′，产物长度531bp。PCR产物各取4μl进行电泳，用UVP凝胶成像系统拍照，并用图像分析软件分析PCR产物条带的灰度值，对XIAP mRNA表达水平进行半定量分析。 5. Western blot检测XIAP基因的表达：收集转染后48h的HepG2细胞，用细胞裂解液抽提细胞总蛋白质，实验组和对照组细胞分别取总蛋白质7μg后电泳并转膜。加入1∶500鼠抗人XIAP单克隆抗体孵育过夜，并以β-肌动蛋白为内参照。化学发光（ECL）法显色。用凝胶图像处理系统分析目的条带灰度值，进行XIAP蛋白表达水平的半定量分析。 6. MTT法检测细胞生长情况：对接种于96孔板的细胞转染后，分别于24、48、72h进行MTT法检测。设置实验组（重组质粒1～4转染组）、空载体组（空载体转染组）、脂质体组（仅加脂质体，不加质粒）、空白组（不加质粒及脂质体）和调零组（不加细胞），每组6个复孔。用酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值（A），以调零组吸光度为基准调零，测得各孔A值。 7. 流式细胞仪检测细胞凋亡：用Annexin V-碘化丙啶试剂盒检测细胞凋亡：分别于转染后24、48、72h收集细胞，制备单细胞悬液，按照Annexin V-碘化丙啶试剂盒说明操作，用流式细胞仪（购自美国BD公司）检测细胞的凋亡率。 8. 统计学分析：实验所得数据资料采用SPSS13.0统计分析软件进行方差分析。 二、结果 1. 重组质粒psiRNA-hH1neo-XIAP的鉴定：根据蓝白斑筛选，取白色克隆株扩增后抽提重组质粒，用AseⅠ内切酶进行单酶切测定，选择酶切鉴定重组成功的质粒进行DNA测序，证实插入的4个shRNA片段碱基序列与设计序列完全一致。 2. 重组质粒转染后各组细胞XIAP基因mRNA的表达结果：4个重组质粒均成功转染HepG2细胞，并不同程度下调XIAP基因mRNA的表达，其中以1号重组质粒抑制效应最强，shRNA作用48h后对HepG2细胞中XIAP mRNA的最大抑制率为94.5%。 3. Western blot检测结果：4个重组质粒均成功转染HepG2细胞并不同程度下调XIAP蛋白的表达，尤以1号质粒产生抑制效应最强。shRNA干扰后，HepG2细胞中XIAP蛋白表达抑制率最高达92.6%。 4. MTT法检测结果：4个重组质粒均成功转染HepG2细胞，并均能抑制其生长（表2）。 表1 （略） 表2 （略） 5. 流式细胞仪检测结果：用流式细胞仪检测实验组及对照组细胞凋亡率，转染后24、48、72h各RNA干扰组细胞凋亡率均明显高于对照组（表3），表明转染重组质粒后特异地下调XIAP的表达，诱导肿瘤细胞凋亡。 表3 （略） 三、讨论 我们前期研究结果显示，在人肝癌组织和肝癌细胞株中XIAP基因的mRNA和蛋白表达水平明显高于癌旁组织与正常肝细胞株，提示XIAP基因的高表达与肝癌的发生发展密切相关[3]。在此基础上，我们构建针对XIAP基因的小干扰RNA真核表达载体，然后转染高表达XIAP基因的肝癌细胞HepG2。转染psiRNA-Hhneo-XIAP后，HepG2细胞XIAP表达明显低于空载体转染组，表明所构建的真核表达载体psiRNA-Hhneo-XIAP能特异性下调XIAP的表达。同时我们观察到将该载体转染到HepG2细胞后能引起被转染细胞凋亡明显增加。在所合成的4个shRNA中，1号shRNA抑制XIAP mRNA和蛋白表达的作用最为明显，与之相一致，1号shRNA诱导HepG2细胞凋亡的作用也最强。研究表明，下调XIAP蛋白表达可使肝癌细胞凋亡明显增加，其促凋亡效应与XIAP下降程度呈正相关。由于XIAP基因的过表达与肿瘤多药耐药性有关[4]，XIAP基因敲除鼠未发现明显病理变化，提示敲除XIAP对正常细胞无毒性[5]，故XIAP基因被认为是具有潜力的肿瘤治疗靶点。在本研究结果中，下调XIAP基因的表达可明显抑制肝癌细胞生长并诱导其凋亡，这将为以XIAP为位点的肝癌靶向治疗提供科学的实验依据。 参 考 文 献 [1]Deveraux QL, Leo E, Stennicke HR, et al. Cleavage of human inhibitor of apoptosis protein XIAP results in fragments with distinct specificities for caspases. EMBO J, 1999, 18: 5242-5251. [2]Yang L, Cao Z, Yan H, et al. Coexistence of high levels of apoptotic signaling and inhibitor of apoptosis proteins in human tumor cells: implication for cancer specific therapy. Cancer Res, 2003, 63: 6815-6824. [3]Tao LW, Lin JS, Chen XP, et al. Expression of XIAP mRNA and protein in human hepatocellular carcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2004, 12: 2788-2791. (in Chinese) 陶璐薇,林菊生,陈孝平,等. 肝细胞癌中XIAP mRNA及蛋白表达的意义.世界华人消化杂志,2004,12:2788-2791. [4]Tong QS, Zheng LD, Wang L, et al. Downregulation of XIAP expression induces apoptosis and enhances chemotherapeutic sensitivity in human gastric cancer cells. Cancer Gene Ther, 2005, 12:509-514. [5]Harlin H, Reffey SB, Duckett CS, et al. Characterization of XIAP-deficient mice. Mol Cell Biol, 2001, 21: 3604-3608. 中华肝脏病杂志版权 |