【摘要】目的 探讨交感神经递质去甲肾上腺素（NE）对HSC细胞株（CSFC）增殖和凋亡的影响。 方法 体外培养CFSC，分为以下6组：（1）空白对照组，为单纯CFSC培养；（2）交感兴奋（NE）组；（3）交感抑制（酚妥拉明+普萘洛尔）组；（4）α肾上腺素受体（AR）阻滞（酚妥拉明）组；（5）β1-AR阻滞（CGP20712A）组；（6）β2-AR阻滞（ICI118551）组。MTT法测定细胞增殖；TUNEL法观察CFSC凋亡状况；流式细胞仪检测细胞凋亡率；倒置相差显微镜观察细胞形态学变化。结果 MTT法显示，NE对CFSC具有明显的促增殖作用，加入α-AR、β1-AR、β2-AR阻滞剂后细胞增殖均受到明显抑制。NE作用于CFSC 24h，TUNEL法显示CFSC的凋亡率显著低于对照组（6.60%±3.05%与12.60%±4.76%, P<0.05）；加入AR阻滞剂后CFSC凋亡率升高，其中α-AR和β2-AR阻滞剂作用最显著。同时，流式细胞仪显示加入NE后CFSC凋亡率也显著降低（2.29%±0.22%与3.06%±0.57%, P<0.05）；与TUNEL结果一致。NE对细胞形态没有明显影响。 结论 交感神经递质NE对体外活化的CFSC具有促增殖作用，并且可以抑制CFSC的凋亡，可能主要通过α受体和β2受体起作用。 【关键词】去甲肾上腺素； 受体，肾上腺素能； 肝星状细胞； 细胞凋亡； 增殖 Effects of norepinephrine on hepatic stellate cell proliferation and apoptosis LIU Na, ZHANG Xiao-lan, TIAN Xiao-peng. Department of Gastroenterology, Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China Corresponding author: ZHANG Xiao-lan, Email: xiaolanzh@ 126.com 【Abstract】 Objective To investigate the effects of norepinephrine (NE) on the proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells (HSCs). Methods Cultured HSCs were used in 6 groups: (1) a control group; (2) a NE group; (3) a phentolamine plus propranolol group; (4) a phentolamine (an α-AR antagonist) group; (5) a CGP20712A (a β1-AR antagonist) group; and (6) a ICI118551(a β2-AR antagonist ) group. After NE and the antagonists of adrenoceptor subtypes were administered to the cultured HSCs, MTT assay was used to evaluate the cell proliferation at 24 h, 48 h, and 72 h. Terminal deoxyribonucleotidyltransferase-mediated dUTP nick end labelling (TUNEL) assay and flow cytometry were used to detect cell apoptosis. An inverted microscope was used to observe the morphological changes of HSCs. Results (1) MTT assay indicated that NE significantly induced HSCs proliferation in a time-dependent manner, which were reduced by antagonist of α-AR, β1-AR and β2-AR. (2) At 24 h after HSCs exposure to NE, apoptosis rates decreased significantly compared with that of the control group (6.60%±3.05% vs 12.60%±4.76%, P < 0.05). In the antagonists of adrenoceptor subtypes groups, especially of α and β2 adrenoceptor subtypes, the apoptosis was less. (3) Apoptosis rate of the NE group was significantly lower than that of the control group (2.29%±0.22% vs 3.06%±0.57%, P < 0.05). In the antagonists of α and β2 adrenoceptor groups the apoptosis was less. (4) No obvious morphological changes of HSCs were found after administration of NE. Conclusions Sympathetic neurotransmitter NE can induce proliferation and inhibit apoptosis of the cultured HSCs. 【Key words】Norepinephrine; Receptors, adrenergic; Hepatic stellate cell; Apoptosis; Proliferation 肝纤维化是各种致病因子引起慢性肝病进而发展为肝硬化的共有病理改变和必经途径。HSC是参与肝纤维化过程的最主要细胞成分[1]。已有研究证实，肝硬化和门静脉高压患者血液循环中去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）和肾上腺素浓度均显著升高，交感神经系统活性增强[2]，提示交感神经系统可能参与了肝纤维化发生发展的调控。我们通过观察交感神经递质NE对HSC增殖和凋亡的影响，深入探讨交感神经系统调节肝纤维化的机制。 材料与方法 1. 试剂及实验仪器：RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）试剂盒购自德国宝灵曼公司，NE、α肾上腺素受体（adrenoceptor，AR）阻滞剂酚妥拉明（phentolamine）、非选择性β-AR阻滞剂普萘洛尔（propranolol）、β1-AR特异性阻滞剂CGP20712A和β2-AR特异性阻滞剂ICI118551均购自美国Sigma公司。倒置相差显微镜购自日本Olympus公司，流式细胞仪（FCM）购自美国Coulter公司。 2. 细胞株与细胞培养：HSC株CFSC由美国Greenwel教授建株并惠赠[3]，其表型为活化的HSC。将冷冻保存的CFSC复苏后接种于含体积分数10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和4mol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养液中常规培养。待细胞贴壁长成致密的单层后，0.25%胰蛋白酶消化，配成细胞悬液，接种于培养瓶，反复接种得到所需的大量细胞。用0.25%胰酶消化对数生长期的细胞，调整细胞浓度为5×104/ml和1×105/ml备用。 3. 实验分组：（1）空白对照组，为单纯CFSC培养；（2）交感兴奋（NE）组；（3）交感抑制（酚妥拉明+普萘洛尔）组；（4）α-AR阻滞（酚妥拉明）组；（5）β1-AR阻滞（CGP20712A）组；（6）β2-AR阻滞（ICI118551）组。NE及阻滞剂浓度均为10μmol/L。 4. MTT法测定细胞增殖：将5×104/ml呈对数生长的CFSC接种于96孔板，每孔200μl，细胞同步化后，分别加入NE及其阻滞剂各10μl，每组6个复孔，另设阴性对照组。培养24、48h及72h时于倒置相差显微镜下观察细胞形态；随后每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，继续孵育4h，加入二甲基亚砜150μl，用酶标仪在570nm波长下测定每孔的吸光度（A）值，以无细胞培养液孔（阴性对照组）调零。 5. TUNEL法观察CFSC凋亡：将呈对数生长的CFSC接种于24孔板，加入NE及其阻滞剂，继续培养24h；收集细胞，用4%多聚甲醛固定，经灭活内源性过氧化物酶、通透、标记、信号转化及二氨基联苯胺显色处理，胞核染成棕黄色者为凋亡细胞。随机取5个高倍视野观察，计数200个细胞中的凋亡细胞数，并计算凋亡细胞的百分比。 6. 流式细胞仪、碘化丙啶染色法检测凋亡率：取1×106细胞，细胞同步化后，实验组加入NE及其阻滞剂继续培养24h；消化收集细胞，用75%冷乙醇溶液固定过夜，经碘化丙啶染液处理，室温避光保存，24h内流式细胞仪检测凋亡率。 7. 统计学分析：MTT法的数据以均数±标准差（x-±s）表示，凋亡率以百分率表示。用SPSS12.0软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用q检验。 结 果 1. NE对细胞形态的影响：CFSC接种于培养瓶中，贴壁生长，大多数细胞呈多角形，约24h后，细胞进入对数生长期，即贴壁生长成致密的单细胞层。NE作用后72h，细胞增殖显著，倒置相差显微镜下未见明显细胞形态改变（图1）。 2. NE对CFSC增殖率的影响：MTT法显示，10μmol/L的NE作用于CFSC，实验组A值均高于对照组，且随时间延长NE促增殖作用增强。加入α-AR、β1-AR、β2-AR阻滞剂后，实验组A值显著下降，HSC增殖受抑制，尤其合用α-AR和β-AR阻滞剂后更明显。见表1。 3. TUNEL法测定NE及其阻滞剂对CFSC凋亡的影响：NE作用CFSC后，其凋亡率显著低于对照组（6.60%±3.05%与12.60%±4.76%, P<0.05）。而加入受体阻滞剂后CFSC凋亡明显增多。加入α-AR阻滞剂（酚妥拉明）和β2-AR阻滞剂（ICI118551）后凋亡率升高明显；加入β1-AR阻滞剂（CGP20712A）后凋亡率也升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。 4. 流式细胞仪检测NE及其阻滞剂作用于CFSC后的凋亡率：NE作用CFSC后，其凋亡率显著低于对照组（2.29%±0.22%与3.06%±0.57%，P<0.05）；而加入各受体阻滞剂后CFSC凋亡明显增多，加入α-AR阻滞剂和β2-AR阻滞剂凋亡率升高最明显，与TUNEL结果一致（表2）。 讨 论 交感神经系统分布广泛，几乎参与了体内所有系统的功能调节[4]。HSC是肝脏主要的纤维生成细胞，可以表达多种神经标志物，并合成和释放NE、多巴胺、5-羟色胺等神经递质[5]，提示HSC可作为肝脏的神经内分泌细胞接受交感神经系统传出的信号，发生表型改变，调节肝脏功能。 在原代培养HSC的培养液中加入交感神经递质NE，HSC数量明显增加，并呈剂量依赖性，提示NE可能对HSC具有促增殖作用[6]。本研究应用体外培养的肝星状细胞CFSC。结果显示，NE对HSC增殖具有明显的促进作用，且呈时间依赖性。交感神经递质NE对全身各系统的调节主要是通过与不同AR亚型结合后激活受体后信号传导通路发挥作用。已有研究证实，HSC可以自身合成释放NE，并表达α-AR、β1-AR、β2-AR等亚型[6]。我们在细胞培养液中添加不同肾上腺素受体亚型的特异性阻滞剂，结果显示NE对CFSC的促增殖作用可以被α-AR阻滞剂、β1-AR阻滞剂和β2-AR阻滞剂分别或共同阻断，因而证实3种肾上腺素受体亚型均参与了NE调节CFSC增殖的过程。 在肝损伤修复过程中，活化HSC数量的减少主要是由于细胞凋亡引起[7]。本研究也检测了交感神经递质NE对CFSC凋亡的影响。TUNEL与流式细胞仪的检测结果均证实，NE作用于HSC 24h，对HSC凋亡具有显著的抑制作用。这一结果提示，NE抑制HSC凋亡可能是其引起HSC数目增多的机制之一。为进一步探索NE影响HSC凋亡的机制，本研究将α-AR、β1-AR、β2-AR的特异性阻滞剂分别作用于HSC，结果显示，α-AR和β2-AR特异性阻滞剂可以明显拮抗NE对HSC的凋亡抑制作用，提示NE抑制HSC凋亡主要是通过α-AR和β2-AR实现的。 本研究证实，NE对CFSC具有促进增殖、抑制凋亡的作用，并确定了在此过程中发挥主要作用的肾上腺素受体亚型。但NE影响CFSC增殖凋亡的受体后信号通路还有待进一步的研究，以期逐步探明NE调节肝纤维化的具体机制，为临床上肝纤维化的治疗提供新策略和新途径。 参 考 文 献 [1]Henderson NC, Iredale JP. Liver fibrosis: cellular mechanisms of progression and resolution. Clin Sci (Lond), 2007, 112: 265-280. [2]Ueno T, Sata M, Sakata R, et al. Hepatic stellate cells and intralobular innervation in human liver cirrhosis. Hum Pathol, 1997, 28: 953-959. [3]Greenwel P, Schwartz M, Rosas M, et al. Characterization of fat-storing cell lines derived from normal and CCl4-cirrhotic livers. Differences in the production of interleukin-6. Lab Invest, 1991, 65:644-653. [4]Mancia G, Bousquet P, Elghozi JL, et al. The sympathetic nervous system and the metabolic syndrome. J Hypertens, 2007, 25: 909-920. [5]Cassiman D, Denef C, Desmet VJ, et al. Human and rat hepatic stellate cells express neurotrophins and neurotrophin receptors. Hepatology, 2001, 33: 148-158. [6]Oben JA, Roskams T, Yang S, et al. Hepatic fibrogenesis requires sympathetic neurotransmitters. Gut, 2004, 53: 438-445. [7]Elsharkawy AM, Oakley F, Mann DA. The role and regulation of hepatic stellate cell apoptosis in reversal of liver fibrosis. Apoptosis, 2005, 10: 927-939. 中华肝脏病杂志版权 |