【关键词】 脂肪肝，非酒精性； 小鼠； 动物模型
Establishment and evaluation of a new animal model of nonalcoholic fatty liver disease in mice XU Lei, XU Cheng-fu, SHI Qiao-juan, YU Chao-hui, LI You-ming.
【Key words】 Fatty liver, nonalcoholic; Mice; Models, animal
【First author’s address】Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, China
Corresponding author: LI You-ming, Email: zlym@ zju.edu.cn
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）疾病谱包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎及肝硬化等多种类型[1]。建立一个稳定可靠的、疾病谱完整的NAFLD动物模型，对研究NAFLD的发病机制及治疗方法有重要的意义。本研究采用胆碱和蛋氨酸缺乏的饲料喂养小鼠，旨在建立NAFLD的小鼠模型。
一、材料与方法
1. 实验动物：SPF级雄性C57/BL6小鼠，体重18～22g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[动物许可证号：SCXK(沪)2003-0003]，于浙江省医学科学院实验动物中心清洁级屏障系统实验室饲养[实验动物使用许可证：SYXK(浙)2003-0001]。
2. 材料和试剂：胆碱和蛋氨酸缺乏（methionine/choline deficient，MCD）饲料购自美国MP公司，正常对照饲料为浙江省医学科学院实验动物中心制备的普通动物饲料。血清ALT、AST由意大利AUTOLAB-PM4000型生化分析仪测得；电镜型号为美国Philips公司的TECNA110型电镜。
3. 动物分组及NAFLD造模方法：将所有小鼠按体重随机分到模型组及正常对照组中，每组36只。两组又按预期饲养时间的不同分为6个小组，分别饲养1、2、3、4、5、8周，每个时间点各6只。所有小鼠用普通饲料适应性饲养5d后，模型组改用MCD饲料喂养，正常对照组则继续用对照饲料喂养。造模开始后每周称量体重，于第1、2、3、4、5、8周末时分别处死相应组别的小鼠。
4. 标本的收集：隔夜禁食12h、不禁水，于次日获取全血标本后颈椎脱臼法处死小鼠。全血标本于4℃冰箱静置1h后3000r/min离心10min分离得到血清，用于血清学指标的检测。处死小鼠后立即取出肝脏，称取肝脏湿重，在肝脏最大叶距边缘5mm处取小块肝组织，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，病理切片，HE染色及天狼红染色（sirus），光镜观察。同时取一大小约1mm3的肝组织，4%戊二醛溶液固定，用于透射电镜观察肝脏的超微结构。
5. 观察指标：（1）造模后一般情况：包括小鼠的饮食、体重、皮毛、活动情况、精神状态等。（2）肝脏病理学：造模后不同组别、不同阶段的小鼠肝脏病理变化，包括脂肪变性、炎症、纤维化情况。（3）肝脏超微结构：观察肝细胞内细胞核、线粒体、内质网，肝窦等超微结构。（4）血清肝功能：血清ALT及AST。
6. 统计学方法：采用SPSS11.5统计分析软件分析，连续变量经过正态性检验和方差齐性检验后符合正态分布和方差齐的采用t检验，不符合则采用Mann-Whitney U检验和确切概率法计算，P<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
1. 小鼠一般情况观察：造模过程中模型组及正常对照组小鼠均未发生意外死亡，正常对照组小鼠体重持续增加；与正常对照组相比，模型组小鼠摄食量减少、精神状态较差、毛发光泽变弱、活动减少、体重减轻。
2. 肝脏病理学变化：正常对照组小鼠肝脏大体观色红、柔软；模型组小鼠肝脏色黄，随着造模时间延长，肝脏质地逐渐变韧。两组间肝指数无明显差异。HE染色结果提示正常对照组小鼠肝脏病理无异常发现。模型组小鼠造模1周时，出现轻度的肝脏脂肪变性（图1）；2周时，出现明显的肝脏脂肪变性，脂变性质为大泡性，主要位于腺泡1区，未见气球样变，未见或偶见小灶性坏死（图2）。随着造模时间的延长，模型组小鼠肝脏脂肪变性程度逐渐加重；5周时，可见气球样变及大量的坏死灶，伴有炎症细胞浸润，坏死及炎症细胞浸润以小叶内更加明显，同时少数肝脏出现轻微窦周纤维化（图3）；8周时，大多出现纤维化、坏死和炎症与5周时变化相似（图4，图5）。
3. 肝脏超微结构变化：正常对照组小鼠肝脏超微结构无明显异常（图6）。模型组小鼠2周时，肝细胞内可见明显的脂滴浸润、线粒体肿胀及嵴减少、粗面内织网减少（图7）；5周时，肝细胞内可见巨大的脂滴浸润、部分线粒体固缩、滑面内织网扩张、粗面内织网明显减少（图8）；8周时，肝脏超微结构变化与5周时相似。
4. 血清学变化：模型组小鼠各个时间点血清ALT、AST水平与同期正常对照组小鼠相比，差异有统计学意义（P<0.05）；造模8周时血清ALT、AST较5周时明显增高（P<0.01，图9，图10）。
三、讨论
目前研究认为NAFLD发生发展是“二次打击”的结果，从而产生多样的肝脏病理表现。人类NAFLD主要指肥胖等代谢相关的脂肪性肝病，其肝脏有相应的病理特征[2]。在动物模型上模拟其病理表现，对研究NAFLD具有重要的作用。
由于生物基因的特殊性，用动物模型模拟人类疾病病理，往往具局限性。目前NAFLD动物模型中，国外采用较多的遗传源性肥胖动物如ob/ob小鼠等，其脂变性质和人类脂变性质相似；然而该模型无法复制出脂肪性肝纤维化[3]。国内多用高脂饲料喂养大鼠，可成功复制出肝脏脂肪变性、脂肪性肝炎及肝纤维化，但成模时间较长，约需半年才有部分大鼠出现肝纤维化。C57BL/6是近交系小鼠，遗传背景明确，个体差异相对较小，广泛用于人类疾病模型。我们采用MCD饲料喂饲C57BL/6小鼠，成功复制了小鼠NAFLD模型。
本模型的机制是采用胆碱和蛋氨酸缺乏的饲料进行饮食干预。胆碱缺乏可能致肝脏VLDL合成障碍及线粒体β氧化障碍，从而使肝脏甘油三酯无法向外转运形成脂肪变性。本研究的结果显示，MCD饲料喂养小鼠1周即可出现轻度的肝脏脂肪变性，2周时出现更为明显肝脏脂肪变性，并且随着喂养时间的延长可以逐步模拟出NAFLD患者的肝脏病理演变过程。本研究还发现，MCD饲料喂养小鼠复制的是以大泡性为主的肝脏脂肪变性。NAFLD患者的肝脏脂肪变性主要分为大泡性和小泡性两种类型，小泡性脂肪变性主要见于急性妊娠综合征及Reye综合征等；而大泡性脂肪变性则占临床NAFLD患者的绝大多数，其发生与代谢综合征密切相关。本研究复制的小鼠NAFLD模型在脂变性质上和大多数NAFLD患者的脂变性质一致。
在二次打击的作用下，肝脏由单纯性脂肪变性发展为脂肪性肝炎，其病理表现以肝脏炎症坏死为特征，常常伴有气球样变、Mallory小体形成、纤维化、糖原颗粒形成等。同时在超微结构上肝脏常可见线粒体肿胀、内质网的变化等。本模型成功的模拟了以上几种病变。我们发现，喂养5周后，模型组小鼠肝脏在脂肪变性的基础上出现了明显的坏死和炎症，部分出现了气球样变及窦周的轻度纤维化；而喂养8周后，模型组小鼠肝脏更是出现了典型的气球样变和纤维化特征。目前研究认为伴有气球样变、或伴纤维化是脂肪性肝炎继续向前演变的标志，纤维化将最终导致肝硬化的发生，因此本模型可以用于研究NAFLD的疾病演变发展过程。但是，本模型在各阶段均表现为体重减轻，这和人类NAFLD常伴肥胖不同；同时本模型ALT及AST升高程度显著较人类NAFLD高。
参 考 文 献
[1]Fatty Liver and Alcoholic Liver Disease Study Group of the Chinese Liver Disease Association. Guideline for diagnosis and treatment of nonalcoholic fatty liver diseases. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2006, 14: 161-163.
中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南.中华肝脏病杂志,2006,14:161-163.
[2]Brunt EM. Pathology of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatol Res, 2005, 33: 68-71.
[3]Leclercq IA, Farrell GC, Schriemer R, et al. Leptin is essential for the hepatic fibrogenic response to chronic liver injury. J Hepatol, 2002, 37: 206-213.
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