【摘要】 目的 探讨大鼠急性肝功能衰竭时内毒素血症对肝脏及肾脏糖异生功能及血糖水平的影响。 方法 24只雄性健康成年SD大鼠，随机分成4组，每组6只，Ⅰ组：腹腔注射等渗盐水；Ⅱ组：腹腔注射400mg/kg D-氨基半乳糖（D-GaLN）；Ⅲ组：腹腔注射400mg/kg D-GaLN+50μg/kg LPS；Ⅳ组：腹腔注射400mg/kg D-GaLN+500μg/kg LPS。LPS注射后6h，取血清检测内毒素、肾功能；取大鼠肝组织及肾组织，采用荧光定量PCR方法检测磷酸烯醇丙酮酸磷酸羧激酶（PEPCK）基因表达。 结果 Ⅰ组、 Ⅱ组大鼠未见明显的内毒素血症，Ⅲ组、Ⅳ组大鼠体内内毒素水平明显升高，Ⅳ组高于Ⅲ组（8.05±0.43对比3.50±2.25，P<0.05）。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组大鼠于LPS注射前后未出现低血糖，Ⅳ组大鼠于LPS注射后6h出现明显的低血糖。各组大鼠肾功能均在正常水平，仅有Ⅳ组大鼠出现血清尿素氮水平轻度增高。大鼠肝脏PEPCK的表达在Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组逐渐减少，差异有统计学意义（2.54±1.32、1.87±0.15、0.91±0.13、0.44±0.42, P<0.05）；大鼠肾脏PEPCK的表达，同Ⅰ组比较，Ⅱ组无明显变化(0.75±0.03对比0.77±0.04, P>0.05)，Ⅲ组明显增强（0.75±0.03对比1.63±0.86, P<0.05），Ⅳ组大鼠肾脏PEPCK表达显著减弱（0.75±0.03对比0.13±0.07, P<0.05）。 结论 急性肝功能衰竭大鼠中严重的内毒素血症通过抑制PEPCK的转录损伤肝脏和肾脏糖异生的功能，导致低血糖的发生。
【关键词】 内毒素血症； 肝功能衰竭，急性； 低血糖； 磷酸烯醇丙酮酸磷酸羧激酶
The effect of endotoxemia on gluconeogenesis in livers and kidneys during acute hepatic failure ZHU Yong-fen, TIAN De-ying, XU Dong, NI Ming, SONG Pei-hui. Department of Infectious Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
Corresponding author: TIAN De-ying, Email: dytian@ tjh.tjmu.edu.cn
【Abstract】 Objective To explore the effects of endotoxemia on gluconeogenesis in livers and kidneys during acute hepatic failure. Method Twenty-four healthy male SD rats were randomly divided into four groups (6 rats in each group) and all of them were injected intraperitoneally with solutions: group I with normal saline, group II with 400 mg/kg of D-galactosamine (D-GaLN), group III with 400 mg/kg of D-GaLN plus 50μg/kg lipopolysaccharide(LPS), and group IV with 400 mg/kg of D-GaLN plus 500μg/kg LPS. At 6 hours after the administration of different solutions intraperitoneally, blood samples were collected to examine blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine. Realtime PCR was used to study the expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) in the livers and kidneys. Results No endotoxemia developed in group I or group II but it was evident in group III and group IV. The level of endotoxemia in group IV was higher than in group III (8.05±0.43, 3.50±2.25, P < 0.05 ). After 6 hours of administration of LPS in group IV, hypoglycemia appeared, and blood glucose was normal in the other three groups. BUN and serum creatinine were all normal in the four groups, except that blood urea nitrogen was elevated in group IV. The mRNA of PEPCK in livers decreased gradually in all the four groups (2.54±1.32 vs 1.87±0.15 vs 0.91±0.13 vs 0.44±0.42, P < 0.05). In the kidneys there was no change in the expression of PEPCK in group I and group II (0.75±0.03 and 0.77±0.04, P > 0.05), but it increased in group III (0.75±0.03 vs 1.63±0.86, P < 0.05), and decreased in group IV (0.75±0.03 vs 0.13±0.07, P < 0.05). Conclusion During acute hepatic failure severe endotoxemia would damage the function of gluconeogenesis in livers and kidneys by inhibiting transcription of PEPCK and this can induce hypoglycemia.
【Key words】 Endotoxemia; Liver failure, acute; Hypoglycemia; Phosphoenolpyruvate carboxykinase
重型肝炎患者常并发低血糖，可能与肝脏糖原的耗竭或者肝脏糖异生功能障碍有关[1]，但其具体机制尚不清楚。内毒素血症是重型肝炎发病机制之一，研究表明大剂量的LPS能够诱导低血糖的发生[2，3]。Lauritsen等[4]的研究结果表明，大鼠和人肝移植的无肝期间，不给予外源性葡萄糖支持治疗，机体血糖水平仍保持稳定，提示机体血糖水平的稳定不仅与肝脏糖异生功能有关，还可能与肝外糖异生系统有关。肾脏是最重要的肝外糖异生器官。磷酸烯醇丙酮酸磷酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK）是糖异生的关键酶，其转录的多少决定着糖异生的速度[5]。本研究探讨了急性肝功能衰竭大鼠内毒素血症对肝脏、肾脏糖异生关键酶PEPCK转录水平的影响及其与低血糖的关系。
材料与方法
一、材料
雄性SD大鼠，180～220g，8周龄，共24只，由同济医学院动物房提供。LPS购自美国Sigma公司；D-GaLN购自重庆医科大学生物工程部；内毒素检测试剂盒购自上海伊华临床科技有限公司；RNA提取试剂购自日本TaKaRa公司；反向PCR所用M2MLV RNA逆转录酶、RNA抑制剂、Taq DNA 聚合酶均购自美国Promega公司；PCR引物由上海英俊生物工程公司合成，胶回收纯化试剂盒购自杭州博日科技有限公司，Realtime PCR Master Mix购自日本Toyobo公司。
二、方法
1. 动物分组及模型建立：24只SD雄性大鼠,随机分为4组, 每组6只,Ⅰ组为等渗盐水组, Ⅱ组为试剂对照组，Ⅲ组、Ⅳ组为急性肝功能衰竭模型组。Ⅰ组：腹腔注射等渗盐水,Ⅱ组：腹腔注射400mg/kg D-GaLN，Ⅲ组：腹腔注射400mg/kg D-GaLN+50μg/kg LPS，Ⅳ组：腹腔注射400mg/kg D-GaLN+500μg/kg LPS。动物准备：每组大鼠于恒温标准条件饲养1周，1周后各组大鼠做以下处理，禁食10h，Ⅰ组腹腔注射等渗盐水, Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组腹腔注射400mg/kg的D-GaLN, 2h后, Ⅰ、Ⅱ组腹腔注射等量等渗盐水，Ⅲ组腹腔注射50μg/kg LPS，Ⅳ组腹腔注射500μg/kg LPS,各组大鼠于实验过程中禁食，但不禁水。腹腔注射LPS 6h后戊巴比妥钠麻醉大鼠，股静脉取血，分离出血清置-80℃保存，取肝组织，肾组织置于-80℃保存。
2. 肾功能检测采用全自动生化检测仪检测。
3. 内毒素检测: 内毒素检测采用上海医华临床科技有限公司的基质显色试剂盒，具体操作按试剂盒说明书进行，玻璃管器材220℃高温烤4h，塑料耗材为无热源材料，标准曲线取0.030、0.065、0.125、0.250、0.500、1.000EU/ml，低于0.030EU/ml者视为阴性，高于1.000EU/ml者则将样品稀释10倍后检测。
4. 荧光定量PCR：（1）RNA提取与cDNA的合成：取50mg肝组织及肾组织，采用TaKaRa公司的RNA提取试剂提取RNA，经紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度。取2μg总RNA逆转录成cDNA。（2）引物：PEPCK引物序列，上游为5′-CGCTGGATGTCAGAAGAGG-3′，下游为5′-GCAGTGAGTTCCCACCGTAT-3′；β-actin上游为5′-CATTGAACACGGCATTGTCA-3′，下游为5′-AGGATGGCATGAGGGAGC-3′。所有引物均采用primer5.0设计，经过NCBI Blast验证产物的特异性。（3）标准曲线制作：将对照组cDNA进行PCR扩增，所得产物PEPCK及β-actin分别进行1.5%凝胶电泳，目的基因切下进行纯化回收，回收产物进行电泳鉴定后，依次对比稀释后制作标准品，行荧光定量扩增制作PEPCK及β-actin的标准曲线。(4)实时荧光定量PCR：试剂采用Toyobo公司的SYBR Green Ⅰ Realtime PCR mix。PEPCK PCR反应条件如下: 95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共40个循环。β-actin: 95℃预变性5min；95℃变性15s, 59℃退火15s, 72℃延伸20s，共40个循环。PCR反应在罗氏Lightcycler实时荧光定量PCR仪中进行。每次PCR中均设有标准品及不加模板的阴性对照。根据标准曲线及标准品分别计算出PEPCK及β-actin在组织中的表达量；各组织中PEPCK的相对表达量由PEPCK/β-actin的比值表示。
5． 统计学方法：所有资料处理用SPSS10.0软件包进行分析，检测结果以x-±s表示，各组之间采用单因素方差分析。两组之间的比较采用t检验。
结 果
1．各实验组大鼠血清内毒素水平：Ⅰ组及Ⅱ组大鼠体内均未形成明显内毒素血症，Ⅲ组、Ⅳ组大鼠检测出明显的内毒素血症，大鼠血浆内毒素分别为（3.50±2.25）EU/ml、（8.05±0.43）EU/ml，Ⅳ组大鼠体内的内毒素血症水平高于Ⅲ组，两者差异有统计学意义（P<0.05）。
2. 各组大鼠不同时间血糖变化：LPS注射前1h，注射后2h血糖水平正常，LPS注射后6h，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组大鼠血糖水平正常，Ⅳ组大鼠发生低血糖（P<0.05，图1）。
3. 各实验组大鼠肌酐和尿素氮检测：各组大鼠血清肌酐均在正常水平[6]，而C组尿素氮水平有轻度升高（表1）。
4. 荧光定量PCR检测各组大鼠肝脏和肾脏PEPCK表达：与Ⅰ组比较，Ⅱ组肝脏PEPCK的转录虽然减少，但是差异没有统计学意义，而Ⅲ、Ⅳ组肝脏PEPCK的转录减少，差异有统计学意义(P<0.05)。肾脏PEPCK的表达在Ⅰ组及Ⅱ组之间的差异不明显（P>0.05），在Ⅲ组可以见到PEPCK的表达增高，Ⅳ组PEPCK的表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05，表2）。
讨 论
研究表明，IL-1、IL-6、TNFα能够抑制肝脏PEPCK的转录，损伤肝脏糖异生的功能，与内毒素休克晚期发生的低血糖密切相关[7-9]。由于感染及肠道菌群紊乱的发生，重型肝炎患者经常并发不同程度的内毒素血症[10]。本研究探讨了急性肝功能衰竭大鼠体内的内毒素血症对肝脏、肾脏糖异生关键酶PEPCK表达的影响及其与低血糖之间的关系。
本研究中，Ⅲ组、Ⅳ组均为成功构建为急性肝功能衰竭的模型[4]。内毒素检测显示，等渗盐水组及药品对照组均未形成内毒素血症；Ⅲ组、Ⅳ组大鼠体内可检测到明显的内毒素血症，其中Ⅳ组体内的内毒素水平更高。同时LPS注射6h后尾静脉检测血糖结果显示，对照组及Ⅲ组大鼠血糖水平均正常，而Ⅳ组大鼠体内则发生明显的低血糖。提示Ⅲ、Ⅳ组能够成功模拟急性肝功能衰竭时不同程度的内毒素血症，而Ⅳ组低血糖的发生可能与体内严重的内毒素血症有关。
与Ⅰ组比较，Ⅲ组、Ⅳ组大鼠肝脏PEPCK的转录减少，肾脏PEPCK的转录在Ⅲ组增高，在Ⅳ组降低。PEPCK是糖异生的关键酶，其转录水平的高低与糖异生的功能正相关[6]。因此，本研究结果提示Ⅲ组大鼠肝脏糖异生受损，但是出现肾脏糖异生功能的代偿；而Ⅳ组大鼠肝脏、肾脏糖异生功能均受损。在D-GaLN诱导的急性肝功能衰竭的大鼠模型研究中表明，大鼠肝脏糖异生功能衰竭，但大鼠血糖水平仍然维持正常；但也有研究结果表明，在人和大鼠，肝外糖异生系统能够维持血糖水平的稳定[4，11]。推测本研究中Ⅲ组大鼠血糖水平稳定可能与肾脏糖异生功能的代偿有关，而Ⅳ组大鼠低血糖的发生则与肝脏和肾脏糖异生功能的损伤有关。
血清肾功能检测结果显示各组大鼠的血清肌酐均在正常水平，Ⅳ组大鼠的尿素氮水平轻度增高，但尿素氮为评价肾功能非特异性指标，受诸多因素影响，可能与升高的蛋白质代谢有关。推测此时大鼠肾脏并未发生器质性损害，PEPCK转录的减少可能只是一种功能性改变。
内毒素为系统性炎性介质，能够诱导各种炎性介质的产生，并随循环到达全身各系统。在急性肝功能衰竭个体，体内严重的内毒素血症诱导炎性细胞因子如TNF、IL-1、IL-6的产生，抑制PEPCK的转录，损伤肝脏及肝外糖异生器官（肾脏）的糖异生功能可能是急性肝功能衰竭大鼠及患者低血糖发生的重要机制之一。
参 考 文 献
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