【摘要】 目的 观察LPS诱导HMGB1在肝实质细胞（HC）与库普弗细胞（KC）的表达和细胞外释放。 方法 培养瓶中分别培养原代HC和KC，24h后收获对照组和500μg/L LPS诱导组两种细胞，反复冻融，用半定量RT-PCR和Western blot 法检测HMGB1 mRNA水平和HMGB1表达水平；接种原代HC和KC于24孔板中，继续培养6、12、24h和48h，Western blot法检测各时间点对照组和LPS诱导组培养液中HMGB1含量。 结果 LPS诱导24h后，与相应对照组比较，HC和KC中HMGB1 mRNA表达水平明显增强（t值分别为31.32和45.90，P值均＜0.05），HMGB1表达水平也明显增强（t值分别为46.19和38.44，P值均＜0.05）；在6、12、24h和48h，对照组两种细胞及诱导组HC培养上清液中仅检测到少量HMGB1，延长培养时间，培养上清液中HMGB1含量无明显变化（F＝1.61，P>0.05）；与对照组比较，诱导组KC培养液中的HMGB1含量在6h无显著增加（t＝1.48，P>0.05），但随培养时间延长，其含量明显增高（F＝42.74，P<0.05），且在12、24h和48h均明显高于对照组（t值分别为21.95，32.39和44.16，P值均<0.05）。 结论 LPS可诱导HC和KC中HMGB1表达增强，HC不主动释放HMGB1，而KC能主动释放HMGB1到细胞外。
【关键词】 库普弗细胞； 肝细胞； 脂多糖类； 高迁移率族蛋白B1
Expression of HMGB-1 and its extracellular release of cultured primary hepatic parenchymal cells and Kupffer cells induced by LPS ZHAO Zhong-fu*, HAN De-wu, LIU Ming-she, ZHANG Guo-ying, ZHANG Yun, YANG Hui, YANG Liu-xu. *Institute of Hepatology, Changzhi Medical College, Shanxi 046000, China
Corresponding author: HAN De-wu, Email: zhaozf_1226 @ 163.com, Institute of Hepatology, Shanxi Medical University, Shanxi 030001, China
【Abstract】 Objective To investigate HMGB-1 expression and its extracellular release of cultured primary hepatic parenchymal cells (HC) and Kupffer cells (KC) that were induced by lipopolysaccharides (LPS). Methods Primary hepatic parenchymal cells and Kupffer cells were cultured in flasks, and some cells were treated with 500μg/L LPS for 24 hours (induced group) and some were not treated with LPS and served as controls. All of the cells were repeatedly frozen-thawed, and the expression levels of HMGB1-mRNA and HMGB1 proteins were detected by semi-quantitative RT-PCR and Western blot respectively. Then HC and KC were subcultured in 24-well culture plates for 6 h, 12 h, 24 h and 48 h, and the HMGB1 protein in culture fluids was detected by Western blot at each time point. Results Compared with the cells in the control group, the expression levels of HMGB1-mRNA in the induced group were significantly increased in both HC and KC at 24 h (t = 31.32 and 45.90, P < 0.05) and the protein levels of HMGB1 showed the same results (t = 46.19 and 38.44, P < 0.05). There was a small quantity of HMGB1 protein in theculture fluids of two control groups and the induced group of HC. However the HMGB1 protein in the induced group of KC were obviously increased with prolonged culture time (F = 42.74, P < 0.05). Compared with the control group, the level of HMGB1 protein in the induced group of KC was not increased at 6 h (t = 9.57, P > 0.05) but was significantly increased at 12 h , 24 h and 48 h (t = 21.95, 32.39, 44.16, respectively P < 0.05). Conclusion LPS could increase HMGB1 expression of HC and KC and HMGB1 release from KC, but not from HC. The results suggest that KC play an important role in triggering inflammation and liver injury.
【Key words】Kupffer cells; Hepatocytes; Lipopolysaccharides; High mobility group box 1
近年研究发现高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）不仅在细胞核内发挥作用，它被释放到细胞外时，可作为一种有效的炎症介质诱发和促进炎症反应[1，2]。大鼠严重烫伤早期HMGB1基因表达改变不明显，烫伤后24h肝、肺组织HMGB1基因表达明显增强，并一直持续至伤后72h。用具有中和内毒素作用的重组杀菌/通透性增加蛋白治疗严重烫伤感染动物，结果发现其在有效降低内毒素水平的同时，能显著降低肝、肺组织内HMGB1 mRNA水平，提示烫伤后肠源性内毒素血症对上调肝、肺组织HMGB1 mRNA的表达具有促进作用[3]。另有资料显示，肝组织中HMGB1 mRNA的表达与伤后24～72h的ALT和AST水平呈显著正相关。我们先前的实验也发现，在LPS和D-氨基半乳糖胺（D-galactosamine，D-GalN）诱导的大鼠急性肝损伤时，肝组织中HMGB1的表达增强[4]。以上资料提示肝组织局部HMGB1诱生与器官功能损害关系密切，但上述研究因未能说明肝组织中HMGB1增多是坏死组织细胞的被动释放，还是被激活的库普弗细胞（kupffer’s cells，KC）主动释放，因此不能明确库普弗细胞表达HMGB1在介导炎症反应中的作用。为验证经LPS诱导KC表达和释放HMGB1的作用，本实验观察了经LPS诱导后HMGB1在原代培养的肝实质细胞（hepatic parenchymal cells，HC）和KC的表达及胞外释放。
材料与方法
1．材料：健康成年雌性Wistar大鼠，清洁级，体重180～220g，由山西医科大学动物实验中心提供。Ⅳ型胶原酶、LPS和Centricon YM-100、YM-3均购自美国Sigma公司；乙二醇双（2-氨乙基）四乙酸（EGTA）和4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）购自美国Amresco公司；高糖型RPMI 1640和DMEM培养基购自美国Gibco公司；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；EDTA购自华美生物工程公司；多黏菌素B购自广东环凯微生物科技有限公司；低相对分子质量标准品购自美国Sigma公司；人HMGB1抗体购自英国Abcam公司；ALP标记的第二抗体购自美国Sigma公司；HMGB1和GAPDH PCR扩增引物由武汉伯杰生物技术公司合成；重组HMGB1（r HMGB1）由长治医学院肝病研究所制备。
2．原代细胞的分离及LPS刺激培养：（1）HC的分离、培养：参照文献[5, 6]的方法，用1%戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉大鼠后，剖腹，分离门静脉并插管，首先用无Ca2+/Mg2+-GBSS液灌注至肝脏呈棕褐色，然后用0.5g/L Ⅳ型胶原酶/GBSS液灌注至肝表面有明显渗出，取肝脏，去除包囊和结缔组织，剪碎，100目尼龙网过滤，离心，收集肝细胞，培养于含100ml/L小牛血清、胰岛素5mg/L、促肝细胞生长素20mg/L、L-谷氨酰胺30g/L、HEPES 50mmol/L、多黏菌素B 10mg/L、青霉素1×105U/L、链霉素100mg/L的RPMI 1640培养液中。（2）KC的分离、培养：参照文献[7]的方法，分离出肝组织，获取细胞悬液后，4℃，5000r/min离心5 min，重复3次，去除HC，低渗法除去红细胞，获取非实质肝细胞。37℃，体积分数5% CO2条件下用RPMI 1640培养1h，去除未贴壁细胞，得到贴壁KC。聚苯乙烯乳珠吞噬功能检查，证实KC纯度＞95%后，继续培养于RPMI 1640液中。锥虫蓝染色证实两种细胞活细胞百分率>95%后，设对照组和500μg/L LPS诱导组，每组设5个重复。培养瓶中分别培养原代HC和KC，24h后弃去培养液，PBS液调整细胞浓度为1×106个/ml，对照组和诱导组的两种细胞悬液各取8ml，用于半定量RT-PCR和Western blot法检测；用含血清的DMEM培养液调整细胞密度为1×105个/ml接种于24孔培养板中。继续培养 6、12、24、48h，每个时间点接种5个复孔，于各时间点收集培养上清液，用于Western blot检测。
3. HMGB1 mRNA表达水平检测：分别收获细胞提取mRNA，收集有细胞的离心管，各加1ml Trizol，吹打混匀至黏稠为止，移入进口的1.5ml EP管中，常温静置15min。每支EP管中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡混匀30s，然后15000r/min离心15min，可以看到中间白色带为蛋白质层，上层为水相。小心将上层水相约500μl移至另一EP管中，并加入等量异丙醇，充分混匀后室温静置10min。15000r/min离心10min。弃掉上清液，加入75%乙醇洗涤2次，将上清液吸干，室温干燥30min，待产物呈半透明状，加入50μl灭菌去离子水溶解RNA。吸取5μl RNA溶液，稀释400倍至2000μl，紫外分光光度计检测RNA浓度。采用RT-PCR方法扩增HMGB1。HMGB1上下游引物分别为：5′-CGGGATCCGATGGGCAAAGGAGATCCTAA AA-3′和5′-CCCTCGAGTTCATCATCATC ATCTTCTTCTTCA-3′；以GAPDH作为内对照，上下游引物分别为：5′-ACCACAGTCCATGCC ATCAC-3′和5′-TCCACCACCCTGTT GCTGTA-3′，PCR条件为94℃ 30s、57℃ 25s、72℃ 45s，共35个循环。在紫外透射仪下观察，样本为位于约648bp处的条带，凝胶扫描成像分析仪对各检测样本648bp特异条带进行半定量分析。分别以对照组两种细胞HMGB1 mRNA转录水平为标准，计算诱导24h后转录水平的变化：增加倍数＝诱导后特异条带吸光度（A）值／对照组特异条带A值。
4．Western blot检测细胞内和培养液中HMGB1含量：首先按10、20、40、80、160μg/L梯度稀释rHMGB1对照样品，Western blot检测，并用Image-Pro Plus 5.0图像分析系统，测定各稀释度的总吸光度（IA）值并建立IA值与HMGB1含量曲线方程。分别收获细胞，超声仪粉碎，5000r/min离心10min，取上清液；收集各时间点培养液，用Centricon YM-100过滤，除去细胞碎片；再用Centricon YM-3浓缩15倍。紫外分光光度计检测各样品中的蛋白质含量。待测样品均取100μg，与1倍量上样缓冲液混匀，在微量加热器中95℃加热5min后，15%的聚丙稀酰胺凝胶中电泳，并电转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭过夜后，加入1∶1000稀释的小鼠抗人HMGB1单克隆抗体，4℃过夜，TBS洗膜后，加入1∶1000稀释的ALP标记的羊抗鼠抗体，室温孵育2h，TBS洗膜后，BCIP/NBT显色，当特异性蛋白质带颜色不继续加深后，终止反应。测定各样品的IA值，根据IA值与HMGB1含量曲线方程，计算检测样品中HMGB1含量。
5. 统计学分析：两组间数据比较采用t检验，组内各时间点数据比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果
1．对照组与LPS诱导24h组HC和KC HMGB1 mRNA转录水平比较：对照组HC和KC的HMGB1 mRNA转录水平均较低，LPS诱导HC和KC 24h后，HMGB1 mRNA转录水平均显著增强，分别是对照组的3.46倍和7.15倍（图1，2），差异有统计学意义（t值分别为31.32和45.90，P值均＜0.05）。
2．对照组与LPS诱导24h组HC和KC中HMGB1表达水平比较：用Western blot检测10、20、40、80、160μg/L梯度稀释rHMGB1对照样品（图3），Image-Pro Plus 5.0图像分析系统读取各稀释度的IA值，建立曲线方程：y＝7.031＋1.383x。对照组两种细胞中HMGB1均为低水平表达，其含量分别为（0.045±0.003）%和（0.047±0.004）%；LPS诱导24h后，HC和KC内HMGB1含量分别为（0.150±0.011）%和（0.208±0.009）%，诱导组与对照组比，两种细胞内HMGB1含量均显著增加，差异有统计学意义（t值分别为46.19和38.44，P值均＜0.05），见图4，5。
3．HC和KC培养上清液中HMGB1含量比较：在6、12、24、48h各时间点，对照组两种细胞及诱导组HC培养上清液中仅检测到少量HMGB1，延长培养时间，培养上清液中HMGB1含量均未见增多；与对照组比较，诱导组KC培养液中的HMGB1含量在6h无显著增加（t＝1.48，P>0.05），但随培养时间延长，其含量显著增加（F＝42.74，P<0.05），且在12、24h和48h均显著高于对照组（t值分别为21.95，32.39和44.16，P值均<0.05），见表1。
讨 论
Scaffidi等[8]发现，坏死细胞可被动释放HMGB1到细胞外，引发炎症反应，而凋亡细胞的HMGB1与染色质紧密结合，不被释放到细胞外，即使凋亡细胞被巨噬细胞清除时HMGB1也不被释放，从而避免炎症反应发生，因此认为HMGB1只有细胞外释放才能发挥致炎作用。Mosevitsky等[9]在研究HMGB1分布的组织特异性时，发现在正常大鼠HC胞质中仅有少量HMGB1的表达。Tsung等[10]用组织免疫荧光法发现，在肝组织缺血/再灌注后，HMGB1在细胞核和胞质中表达可以增强。我们先前的实验也发现，在LPS/D-GalN诱导的大鼠急性肝损伤时，肝组织中HMGB1的表达增强[4]。
诱导作用使HC中HMGB1表达增强的生物学意义虽还不十分清楚，但如果在此基础上，体内外致病因素进一步损害肝细胞，而造成坏死或凋亡时，则可能引发不同的病理结果。因此，HMGB1在HC表达增强是否参与和介导肝组织炎症反应，主要取决于致病因子是否造成HC坏死。致肝损伤因素包括病毒、细菌、毒物、药物和乙醇等，不同因素及相同因素不同的作用剂量可能造成不同的损伤。本实验结果显示，虽然经LPS诱导24h后，HC中HMGB1表达增强，但在6、12、24h和48h各时间点，诱导组培养液中HMGB1含量差异无统计学意义；与对照组比，各时间点HC培养液中HMGB1含量也无显著增加，表明LPS虽能诱导HC中HMGB1表达增强，但并不诱导其释放HMGB1。许多实验性肝损伤和病毒性肝炎病理组织检查证实，肝细胞凋亡是肝损伤时始终存在的病理改变，而坏死只在疾病的某个阶段发生[11]，提示在病理损伤早期或肝细胞坏死不占主导地位的病理损伤过程中，HC被动释放HMGB1可能对介导肝损伤的作用不大。然而，也有一些毒物、药物或超敏炎症反应等也可造成大量肝细胞坏死，因此，也不排除致损伤因素能直接参与肝细胞坏死的病理过程中，起促进炎症反应和损伤进展的作用。
既往研究表明，在生理状态下，存在于全身各组织器官的巨噬细胞和血管内皮细胞在细胞核中都有HMGB1的表达，在炎症刺激下，这些细胞被激活，能大量主动释放HMGB1，促进炎症反应[12-14]。巨噬细胞对HMGB1的表达和释放与TNFα和IL-1等致炎因子比较，具有延迟释放和持续作用时间长的特点[1, 15]。因此，认为HMGB1是位于TNFα和IL-1下游介导炎症级联反应（inflammation cascade reaction）的一种新的细胞因子。KC是定位于肝脏的巨噬细胞，在肝组织炎症和损伤，甚至全身炎症反应和多器官功能障碍等病理过程中起关键作用[16]。本实验结果显示，经LPS诱导6h，HC和KC培养液中HMGB1含量差异无统计学意义；但在继续诱导12～48h后，KC培养液中HMGB1显著增加，且明显高于相应时间点的HC培养液中HMGB1含量，LPS诱导KC表达和释放HMGB1的特点，与文献报道巨噬细胞的表达和释放特点一致，提示KC通过表达和释放HMGB1在介导肝脏炎症反应中作用的重要性。
参 考 文 献
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