2型糖尿病患者常伴有肥胖和脂质代谢紊乱，其脂肪肝的发生率较非糖尿病患者明显增加，到上世纪90年代美国的发病率为40%。而非酒精性脂肪肝（NAFLD）的发生与胰岛素抵抗（IR）、肥胖、2型糖尿病密切相关。本研究通过高糖、高脂饮食诱导并结合小剂量链脲佐菌素(STZ)注射的方法建立糖尿病大鼠模型，再分别给予罗格列酮和二甲双胍进行药物干预治疗，观察高糖高脂饮食诱导的糖尿病大鼠肝脏的病理改变，探讨罗格列酮和二甲双胍对糖尿病脂肪肝的治疗作用。
材料与方法
一、动物饲养及模型制备
健康雌性SD大鼠55只，清洁级，体重180～200 g（购于河北医科大学实验动物中心）。每笼5只，饲养于标准环境，自由进饮食，12 h光照周期。正常喂养1周后随机分为2组，正常对照组（NC组）10只以普通饲料喂养，糖尿病组（DM组）45只喂以高糖、高脂饲料（标准大鼠饲料中添加10%的蔗糖、15%的熟猪油、2%的胆固醇、0.25%的胆酸）。喂养4周后DM组大鼠隔夜空腹腹腔注射小剂量STZ（30 mg/kg），NC组仅注射等体积柠檬酸柠檬酸钠缓冲液。
二、给药方式
8周末将成模的糖尿病大鼠［2］随机分为3个亚组：糖尿病对照组（DMC组）11只，罗格列酮治疗组（DMR组）12只，二甲双胍治疗组（DMM组）10只。从第9周起DMR组给予罗格列酮（葛兰素史克公司生产）每日3 mg/kg溶于蒸馏水灌胃； DMM组给予二甲双胍（华北制药厂生产）每日625 mg/kg溶于蒸馏水灌胃，NC组和DMC组给予等体积蒸馏水灌胃。药物干预10周，整个实验共持续18周。
三、标本采集
大鼠分别于4周、8周末断尾取血测定血糖，1%的戊巴比妥钠麻醉下心脏采血测以备测血清胰岛素（FINs）、TG、TC。18周末断尾取血测定血糖，隔夜空腹以股动脉放血处死动物后，收集血液以测定FINs、TG、TC、ALT、肿瘤坏死因子α(TNF-α)。打开腹腔充分暴露肝脏，取出整个肝脏称取肝脏湿重，从肝脏右叶中部取小块肝组织以备制成石蜡切片进行HE染色及免疫组织化学染色。将剩余肝组织置于78℃超低温冰箱内以备测肝组织TG含量。
四、免疫组化染色和图像分析
TNF-α免疫组化染色采用SP法，DAB显色，并以0.01 mmol/L的PBS缓冲液作空白对照。胞浆及胞核内出现棕黄色颗粒物质为阳性，兔抗大鼠TNF-α多克隆抗体购于博士德生物工程有限公司。
五、统计学处理
所有资料以SPSS 10.0统计软件进行分析，首先用描述性统计和分析研究变量分布，符合正态分布的测定值以±s表示，对偏态分布(TG、TC、FINs、HOMAIR)的变量进行对数转换，使之正态化再进行统计分析，数据以中位数（四分位区间）表示，两组间的比较采用t检验，多组间的比较采用方差分析；胰岛素抵抗指数（HOMAIR）：以空腹血糖与空腹胰岛素乘积除以22.5表示（HOMAIR =FBG×FINs/22.5）［3］。
结果
一、各组大鼠体重、肝重、肝脏指数的变化
4周末DM组大鼠体重较NC组增加差异有显著性；8周末DM组大鼠体重较NC组增加但无显著性差异；18周末DMC组大鼠肝脏湿重、肝脏指数（肝湿重/体重×100%）较NC组升高且具有显著性差异；与DMC组相比，DMR组和DMM组大鼠肝脏湿重、肝脏指数降低；见表1（略）。
二、各组大鼠血糖、胰岛素和HOMAIR的变化
4周末DM组大鼠血清FINs较NC组升高；FBG与NC组相比升高但无显著性差异，HOMAIR 较NC组增加且差异具有显著性，表明大鼠经高糖高脂饮食喂养4周后诱导出胰岛素抵抗。8周末即DM组大鼠注射STZ后4周末，其FBG较NC组明显升高；FINs较注射STZ前降低，但与NC组比较无显著性差异；HOMAIR 较NC组增加且差异具有显著性，至此已成功建立2型糖尿病大鼠模型。18周末DMC组大鼠FBG水平较NC组升高且差异具有显著性(P<0.01)，HOMAIR 较NC组增加且差异具有显著性；与DMC组相比，DMR组和DMM组大鼠FBG、血清FINs水平降低且差异具有显著性见表2（略）。
三、各组大鼠TG、TC、ALT和血清TNF-α水平及药物干预的影响
4周末、8周末DM组大鼠血清TG、TC较NC组增加差异具有显著性。18周末，DMC组大鼠血清TG、TC、ALT较NC组增加差异具有显著性。与DMC组相比，DMR组和DMM组大鼠血清TG、ALT、肝组织TG、血清TNF-α降低且差异具有显著性。见表3（略）和表4（略）。
四、肝脏病理改变及TNF-α在肝脏的蛋白表达
NC组肝细胞排列整齐，肝小叶规则，细胞中央有大而圆的核，细胞质均匀。DMC组大鼠肝细胞肿胀、体积较正常明显增大，细胞内可见大小不等的脂滴空泡，严重者胞质疏松呈渔网状改变，且存在小叶内及汇管区炎细胞浸润。DMR组和DMM组肝细胞较糖尿病对照组肝细胞体积明显缩小，胞质内可见细小的脂滴。免疫组化结果显示：NC组肝组织内仅有少量棕黄色颗粒；DMC组肝组织内棕黄色颗粒明显增多，以肝窦周围及汇管区明显；DMR组和DMM组肝组织内棕黄色颗粒较DMC组明显减少。图像分析结果显示：DMC组肝脏TNF-α的IOD明显高于NC组差异具有显著性，DMR组和DMM组TNF-α的IOD较DMC组降低差异具有显著性。
讨论
2型糖尿病常伴有肥胖、脂质代谢紊乱，外周脂肪组织分解增加，游离脂肪酸形成增多，进入肝脏的脂肪酸增加使肝脏内甘油三酯形成增加。本研究通过高糖、高脂饮食诱导的SD大鼠4周末即出现肥胖、脂质代谢紊乱和胰岛素水平升高，18周末DMC组大鼠肝脏呈现严重的脂肪变性，肝组织甘油三脂含量、肝脏指数较NC组显著增加。
肥胖的IR大鼠模型脂肪组织的TNF-α mRNA表达增加［4］且与胰岛素抵抗程度呈正相关［5］。TNF-α除可通过促进IR的形成在NAFLD的发病机制中间接发挥作用，其作为一种炎性因子在脂肪肝形成的“二次打击”中发挥直接作用，促进NASH的发生。在本研究中，18周末DMC组大鼠肝脏经病理证实存在严重的脂肪变性，且TNF-α在肝脏的表达明显增加。
罗格列酮是PPARγ的人工配体，在体内可激活PPARγ增加胰岛素敏感性。罗格列酮除可通过提高靶组织胰岛素敏感性，使循环胰岛素水平降低，阻断了高胰岛素血症对肝脏脂肪合成的诱导作用，还可直接抑制肝细胞脂酰CoA合成酶4（acy1 CoA syntheases 4,ACS4）的活性，抑制肝脏合成脂肪［6］，这一作用并不依赖于PPARγ的激活。此外，罗格列酮可抑制脂源性TNF-α的分泌［7］，逆转TNF-α诱导的GLUT4及PPARγ的下调，发挥改善IR的效应。二甲双胍虽然没有直接促进胰岛素分泌的作用，但它通过纠正糖毒性，改善外周组织的胰岛素抵抗状态，对胰岛素的分泌产生继发作用。此外，体外实验研究表明二甲双胍能够逆转FFA对β细胞的毒性作用对脂肪代谢也具有改善作用［8］。本研究结果显示，罗格列酮可以明显降低血糖、血清胰岛素水平，使血清TNF-α水平下降，并使肝组织TNF-α蛋白的表达明显降低；尚可显著降低血清TG、ALT及肝组织TG的水平，减少了脂质在肝脏的聚积，与以往研究结果一致［9，10］。二甲双胍对糖、脂代谢紊乱及IR均有改善作用，还可使肝脏脂肪沉积明显减少，减轻肝脏的脂肪变程度。
参考文献
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