【摘要】 目的 分离制备高、低转移潜能肝癌细胞exosomes，并研究负载相应exosomes的树突状细胞（DC）激活的T淋巴细胞在体外杀伤肿瘤细胞的作用。分析不同转移潜能肝癌细胞系分泌的exosomes的成分差异。 方法 采用四步离心法分离exosomes，电镜观察。分离小鼠DC，并且负载高、低转移潜能细胞株的exosomes，激活T淋巴细胞后，采用3H-TdR掺入法进行体外混合淋巴细胞反应。应用蛋白质组学弱阳离子交换芯片（SELDI-TOF-MS）检测不同转移潜能肝癌细胞分泌的exosomes蛋白成分的差异。结果 电镜观察高转移潜能的肝癌细胞分泌的exoxomes的密度分布、exosomes内容物均不同于低转移组。CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，在高转移组分别为64.27±5.00、44.89±10.11、84.35±19.89、59.03±19.37，低转移组分别为71.53±4.85、50.01±9.50、80.68±29.87、58.86±21.11，与对照组相比P>0.05，负载exosomes后测得cpm值在高转移组为528.40±179.06，低转移组为78.80±24.44，与对照组相比P<0.01。蛋白质组学弱阳离子交换芯片结果表明高、低转移组细胞系的exosomes蛋白组分有着明显的差异。 结论 exosomes具有潜在的免疫治疗价值，在肝癌的转移和复发防治以及生物治疗中具有应用前景。
【关键词】 癌，肝细胞； 转移； 免疫治疗
A preliminary study of the killing function in vitro by T lymphocytes activated by dendritic cells loaded with exosomes secreted by hepatic cancer cell lines with high or low metastatic potentials WANG Kai-feng*, YE Sheng-long, SONG Li-jie, CUI Jie-feng, WENG Yong-qiang, LIANG Chun-min, SUN Rui-xia, TANG Zhao-you. *Liver Cancer Institute, Fudan University, Shanghai 200032, China
Corresponding author: YE Sheng-long, Email: slye@ shmu.edu.cn
【Abstract】 Objectives To study the tumor cell killing function of T lymphocytes stimulated by dendritic cells (DC) and to analyze the differences of protein contents of exosomes in each type of cell. Methods The exosomes of hepatic cell lines with high (P group) or low (F group) metastatic potentials were isolated by a process of four-step centrifugation and the collected exosomes were observed under an electron microscope (EM). The tumor cell killing experiment was performed by adding T lymphocytes activated by DC loaded with exosomes from corresponding P and F group cells and was studied using 3H-TdR experiments. The proteomic analysis was performed by surface-enhanced laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS ) on the exosomes of P and F group cells. Results The density distribution and content of exosomes in the P group were not equal to those in the F group observed by EM. The CD80, CD86, MHC-I and MHC-II in the P group were 64.27±5.00, 44.89±10.11, 84.35±19.89 and 59.03±19.37, and those in the F group were 71.53±4.85, 50.01±9.50, 80.68±29.87 and 58.86±21.11, respectively (P > 0.05, compared with the control group). The counts per minute value in the P group was 528.40±179.06 and 78.80±24.44 in the F group after being loaded with exosomes (P < 0.01, compared with the control group). There were significant differences between the proteins in the exosomes of hepatic cancer cell lines with high or low metastatic potentials. Conclusion Exosomes have potential values of application in immunotherapy and in biotherapy for recurrences and metastases of hepatic carcinomas.
【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Metastasis; Immunotherapy
Exosomes是起源于内吞体系统并被排出于细胞外，直径为30～100nm的膜被小体，该小体内含有许多与来源细胞某些功能相关的蛋白质或脂类[1]。在肿瘤治疗模型中，细胞分泌的exosomes具有潜在的免疫调节功能，因而受到了广泛的关注并进行了广泛的研究[2-4]。肿瘤来源的exosomes富含HSP70～90分子伴侣、肿瘤共同抗原，是一种新型的肿瘤排斥抗原的来源，引起了人们广泛的兴趣[5]。本研究应用淋巴道高、低转移潜能的肝癌细胞株对肝癌细胞的exosomes制备、DC负载及激活后的T淋巴细胞体外杀伤作用进行了探讨。
材料与方法
1. 主要的实验材料和实验器材：无血清培养基购自美国Gibco公司，透射电镜（PHILIPS CM-120）由复旦大学医学院电镜室提供。超速离心机（Type80i）购自美国Beckman公司，蛋白质组学弱阳离子交换芯片购自美国Ciphergen Biosystem公司。SELDI蛋白裂解液由复旦大学肝癌研究所黄成博士惠赠。
2. 实验动物和实验细胞的准备：小鼠高淋巴结高转移潜能细胞株（Hca-P），低转移潜能细胞株（Hca-F）购自大连医科大学。在含有10%小牛血清的RPMI 1640中，置于37℃、含有5% CO2温箱中常规培养、传代。Balb/c小鼠，雄性，4～6周龄，体重20g左右，购于复旦大学医学院实验动物中心。实验分为6组：负载P抗原T淋巴细胞+P肿瘤细胞（A组）、负载F抗原T淋巴细胞+F肿瘤细胞（B组）、负载Pex T淋巴细胞+P肿瘤细胞（C组）、负载Fex T淋巴细胞+F肿瘤细胞（D组）、裸鼠T淋巴细胞+P肿瘤细胞（E组）、裸鼠T淋巴细胞+F肿瘤细胞（F组）。
3. 高、低转移肝癌细胞exosomes的分离：复苏冻存的Hca-F、Hca-P肝癌细胞，调整细胞数量至1×108个，应用无血清培养基在37℃、含有5% CO2温箱中常规培养48h。取出培养的细胞于300×g离心10min，留取细胞上清液，备下一步实验用。Hca-F、Hca-P肝癌细胞exosomes的分离采用文献[6]的方法并加以改进。采用四步离心的方法：（１）4℃，300×g，离心10min，弃沉淀，留上清液；（２）4℃，1200×g，离心30min，弃沉淀，留上清液；（3）4℃，10000×g，离心30min，弃沉淀，留上清液；（4）4℃，100000×g，离心60min，弃上清液，留沉淀。将所分离的沉淀，用1.5ml PBS充分溶解后，通过0.22μm的微孔滤膜过滤。取滤液，进行下一步的抗原负载。
4. 高、低转移潜能的肝癌细胞分泌的exosomes的透射电镜观察：参考常规透射电镜观察方法，由复旦大学上海医学院电镜中心完成。简言之，将四步离心法分离得到高、低转移潜能细胞株的exosomes，用2.5%戊二醛固定后进行脱水处理，再用100%丙酮+包埋液（2∶1）室温下包埋，之后于烘箱内固化。完毕后于LKB-1型超薄切片机切片50～60nm，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，进行电镜观察。
5. exosomes对DC的负载及表型的检测：取4只20g左右的Balb/c小鼠，引颈处死后于超净台上取股骨及胫骨，剔除骨上的肌肉及肌腱组织，置有PBS的培养皿中。用10ml注射器吸取PBS将小鼠股骨、胫骨中的骨髓冲洗至培养皿中。吸取细胞悬液，800×g离心5min后弃上清液，迅速加入9.5ml无菌的双蒸水以及0.5ml的20×PBS（不超过15s），吹打均匀，破红细胞膜。计数后再800×g离心5min，弃上清液，调节细胞浓度至2×106/ml～4×106/ml，于24孔细胞版中培养，同时加入细胞因子IL-4 10μg/L，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子30μg/L。第3天全量换液，此后每2d半量换液（含细胞因子），共培养6～7d备用。
将上述分离得到的高低转移细胞系的exosomes先测定蛋白浓度，经0.22μm微孔滤膜过滤后，按照分离exosomes前肿瘤细胞浓度：DC浓度为1∶3的比例与DC共培养，在37℃、5% CO2条件下培养18～24h。同时将肿瘤细胞抗原负载的DC和未进行抗原负载的DC作为对照组。
培养6d的DC收集后用PBS洗涤2次，调整细胞浓度至1×106/ml，分别加入PE标记的CD80、CD86、以及MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ单克隆抗体10μl，4℃避光孵育30min后由中国科学院上海细胞研究所流式细胞仪室进行检测。
6. T淋巴细胞的活化：取两只Balb/c小鼠，处死后，取脾脏，于200目筛网研磨过滤，取上清液，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，再经T淋巴细胞分离柱分离出T淋巴细胞（按照试剂盒操作说明书操作），计数后备用。将负载exosomes和未负载exosomes的DC细胞与T淋巴细胞在24孔板内进行共培养，DC∶T约为1∶20，培养72h后，小心吹打，吸取悬浮细胞，调节细胞浓度至1×107/ml，置于冰浴上。
7. 活化后T淋巴细胞对高、低转移潜能肝癌的体外杀伤作用：将上述T淋巴细胞PBS洗涤3次，悬浮于完全培养基中，调整细胞浓度为2×106/ml。T淋巴细胞和肿瘤细胞按20∶1加入96孔圆底培养板，终体积200μl，每组设5个复孔，37℃、5% CO2条件下培养72h后，每孔加入3H-TdR 37kBq，继续培养16h收集细胞，液闪计数仪测cpm值，由上海免疫学研究所协助完成，结果以5孔均值表示。
8. 不同转移潜能的小鼠肝癌细胞蛋白质组学弱阳离子交换芯片（WCX 2）的初步研究：参照仪器说明书进行，将四步离心法分离出Hca-P、Hca-F细胞的exosomes。加入蛋白裂解液，充分裂解1～2h，小心取出WCX2的芯片，装入生物芯片处理器，每孔加入200μl结合缓冲液，置振荡器400～600r/min震荡5 min，甩掉缓冲液。在芯片处理器每孔中加入100μl处理好的样品，置振荡器400～600r/min, 4℃震荡1h。取出芯片后，待干，在每个加样孔上加SPA 0.5μl，即可上机进行SELDI优化后参数设置测定。
9. 统计学方法：本研究采用SPSS11.0对实验结果进行单因素方差分析。
结 果
1. DC细胞的培养照片和抗原负载前后的电镜观察：抗原负载后的DC细胞周围的树突减少，细胞表面出现不规则的皱褶，可见突触的残留痕迹，形态出现类似于“成熟样”改变，未见明显的具有特征性树突明显向四周伸出的DC。抗原未负载可看到DC周围有明显的树突，并且可以看到DC与T淋巴细胞的作用，见图1。
2. 高、低转移潜能小鼠肝癌细胞分泌exosomes的电镜观察：经过四步离心分离后得到的沉淀，通过透射电镜观察，可以看到高转移潜能肝癌细胞分泌的exosomes密度分布较大、双层膜内容物颜色较深，这与低转移潜能肝癌细胞分泌的exosomes有明显的差异。高转移组与低转移组相比，内容物的含量具有明显的不同，见图2（略）。电镜观察可以看到exosomes成囊泡状，内有深浅不一的内容物。
3. DC细胞表面CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子的流式检测结果：通过测定DC负载抗原前后的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD80、CD86检测表明，抗原负载后的DC细胞CD80、CD86表达降低，但是经单因素方差分析，差异无统计学意义。MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表达在抗原负载前后，差异无统计学意义，经过单因素方差分析，P>0.05，见表1（略）。
4. 激活T淋巴细胞对肿瘤的体外杀伤作用：exosomes负载后的激活的T淋巴细胞组（C、D组）体外杀伤肿瘤细胞的效应与对照组（E、F组）相比，cpm值明显的低于对照组，具有明显的杀伤作用，经单因素方差分析P<0.01。应用exosome负载的DC刺激的T淋巴细胞组（C、D组）cpm值明显的低于肿瘤细胞抗原激活T淋巴细胞组（E、F组），经单因素方差分析P<0.01，见表2（略）。
5. SELDI-TOF-MS蛋白质组学分析：以测定值相差2倍以上的为有意义，差异蛋白的分子量主要集中在20×105～150×105。高转移组有43种蛋白的含量明显低于低转移组，主要集中在20×105～62×105；有25种蛋白的含量高于低转移组，主要集中在68×105～280×105,见图3（略）。
讨 论
肝癌免疫研究的关键之一是寻找肝癌细胞免疫逃逸的机制或者寻找特异性的肝癌抗原。对于后者，研究者们从肝癌细胞及其培养上清液中提取出具有免疫抑制活性的多肽物质，如原发性肝癌分泌的甲胎蛋白，而更多的是一些结构和生物学功能还不太清楚的物质。近年国内的研究也进一步对肿瘤细胞的免疫逃逸原因以及新型的免疫治疗方法进行广泛的研究[7，8]。本研究中，将高、低转移潜能的肝癌细胞系分泌的exosomes加以分离，并且在电镜下观察到其分泌的密度的不同。研究发现，肿瘤细胞分泌的exosomes中含有一些特异性的抗原、抗原提呈的相关分子、细胞骨架蛋白以及信号传导相关蛋白等[9]。所以exosomes分泌的多少以及其内容物中相应蛋白的定量可能和肝癌细胞的转移潜能大小的免疫逃逸有关。
在本研究中，DC负载exosomes后的CD80、CD86表达与负载前差异无统计学意义，提示可能在肿瘤细胞中存在某种机制影响了DC的抗原呈递相关分子的表达。电镜观察发现，在抗原负载后的DC树突明显的减少甚至消失，提示DC经过抗原刺激后趋于成熟，由于在多个视野下可以观察到残留的DC树突的痕迹，所以本研究并不认为这是趋向幼稚型的改变。流式细胞仪检测表明MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ在抗原负载前后差异无统计学意义，提示此时的DC对内源性和外源性抗原提呈在负载前后并无太大的变化。所以，在本研究中，DC参与了抗原提呈，但是某种未知因素的存在使DC表面的共刺激分子表达没有发生显著性的变化，虽然exosomes负载后具有了抗原提呈功能。
在本研究中，负载exosomes后的DC激活的T淋巴细胞与肿瘤细胞抗原激活的诱导的T淋巴细胞相比，在体外杀伤肿瘤细胞上，差异有统计学意义，提示exosomes可以更好的诱导出具有杀伤功能的T淋巴细胞，为进一步体内研究肿瘤的过继免疫治疗的新方法提供实验依据。本研究表明，与单纯的负载肿瘤抗原相比，负载肿瘤分泌的exosomes可能会使机体产生更好的免疫应答。该方法是否可以作为肿瘤转移防治治疗的一个方向，有待于进一步深入研究。最近的报道中，已有学者将改良的exosomes应用于临床Ⅰ期的研究[10，11]。对于肿瘤分泌的exosomes研究也越来越深入[12，13]，而且通过对exosomes的进一步研究，可以深入探讨肿瘤免疫逃逸的机制并为发现新的瘤苗提供基础。
在本研究中，通过蛋白质组学弱阳离子交换芯片蛋白组学分析表明，来源相同的高、低转移潜能的肝癌细胞系Hca-F、Hca-P分泌的exosomes其内的蛋白组分具有明显的差异，提示其转移潜能可能和其分泌exosomes的方式引起的免疫逃逸，从而造成免疫无应答，引起进一步的转移有关。肿瘤细胞可以凭借多种方式逃避免疫系统的监控而继续生长。荷瘤机体虽然可以对肿瘤抗原进行识别、加工和递呈，并产生有限的免疫反应，但功能状态十分低下，不能产生有效的杀伤瘤细胞作用。有研究发现，当将肿瘤细胞分泌的exosomes负载到人DC的时候，可以诱导出T淋巴细胞免疫应答。而且来源于肿瘤细胞的exosomes含有共有肿瘤排斥抗原，极大地扩展了exosomes作为肿瘤疫苗的可能性[5]。还有些学者认为，肿瘤细胞产生exosomes与肿瘤细胞的免疫逃逸有关[13]。本研究对高、低转移组的细胞分泌的exosomes进行了初步的蛋白质组学的分析，发现其中有明显的蛋白组分的差异，而且，分子量大的蛋白在高转移潜能的肝癌细胞分泌的exosomes中明显的高于低转移潜能的肝癌细胞。提示肝癌细胞转移潜能的不同可能与exosomes参与的免疫逃逸有关，值得进一步深入研究。应用不同转移潜能的肝癌细胞分泌的exosomes负载DC后，刺激T淋巴细胞，在体外实验中显示了较好的肿瘤杀伤作用，提示其可能是一个有效的免疫治疗靶点之一。
参 考 文 献
[1]Barral AM, Von Herrath MG. Exosomes: Specific Intercellular Nano-Shuttles? Curr Immunol Rev, 2005, 1: 1-6.
[2]Denzer K, Van Eijk M, Kleijmeer MJ, et al. Follicular dendritic cells carry MHC class II- expressing microvesicles at their surface. J Immunol, 2000, 165: 1259-1265.
[3]Hegmans JP, Bard MP, Hemmes A, et al. Proteomic analysis of exosomes secreted by human mesothelioma cells. Am J Pathol, 2004,164: 1807-1815.
[4]Kovar M, Boyman O, Shen X, et al. Direct stimulation of T cells by membrane vesicles from antigen-presenting cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103: 11671-11676.
[5]Wolfers J, Lozier A, Raposo G, et al. Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming. Nat Med, 2001, 7: 297-303.
[6]Wubbolts R, Leckie RS, Veenhuizen PT, et al. Proteomic and biochemical analyses of human B cell-derived exosomes. Potential implications for their function and multivesicular body formation. J Biol Chem, 2003, 278: 10963-10972.
[7]Ma J, Wang YL, Hu HM, et al. Mechanism of augmented anti-tumor immunity in reconstituted lymphopenic mice immunized with melanoma vaccine. Zhonghua Zhongliu Zazhi, 2005, 27: 708-712.
马军,王一理,HU Hong-ming,等.淋巴细胞减少期联合免疫重建和瘤苗免疫增强抗肿瘤免疫的机制.中华肿瘤杂志,2005,27: 708-712.
[8]Wang KF, Ye SL, Xue Q, et al. Influence of reconstruction of immunological function of T lymphocytes on mouse hepatocarcinoma metastasis. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 443-446.
王凯峰，叶胜龙，薛琼，等.T淋巴细胞免疫功能重建对小鼠肝癌转移的影响.中华肝脏病杂志,2005,13:443-446.
[9]Bard MP, Hegmans JP, Hemmes A, et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am J Respir Cell Mol Biol, 2004, 31: 114-121.
[10]Morse MA, Garst J, Osada T, et al. A phase I study of dexosome immunotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer. J Transl Med, 2005, 3: 9.
[11]Escudier B, Dorval T, Chaput N, et al. Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic cell (DC) derived-exosomes: results of thefirst phase I clinical trial. J Transl Med, 2005, 3: 10.
[12]Taylor DD, Gercel-Taylor C. Tumour-derived exosomes and their role in cancer-associated T-cell signalling defects. Br J Cancer, 2005, 92: 305-311.
[13]Whiteside TL. Tumour-derived exosomes or microvesicles: another mechanism of tumour escape from the host immune system? Br J Cancer, 2005, 92: 209-211.
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