【摘要】 目的 探讨化学缺氧对大鼠HSC MMP-2的表达和活性的影响及其调节机制。 方法 用不同浓度的氯化钴（CoCl2，0、50、100、200μmol/L）造成大鼠HSC化学缺氧，RT-PCR、酶图法分别检测MMP-2 mRNA表达及其酶活性；Western blot检测缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达；用荧光素酶报告基因分析技术测HIF-1α对MMP-2基因的激活作用。 结果 随CoCl2浓度从0μmol/L依次递增到200μmol/L，MMP-2 mRNA表达的量（用吸光度值表示）从0.53±0.12依次上调到1.57±0.11，4组间差异有统计学意义（F=34.21, P<0.01），其活性下降幅度（用吸光度值表示）从84.49±5.38逐渐下降至53.70±3.42，4组间差异有统计学意义（F＝29.54, P<0.01），HIF-1α表达量依次增加；核蛋白提取物与MMP-2基因探针（含缺氧反应元件）共浴后，电泳迁移条带产生延迟现象，竞争性序列能部分拮抗其结合。 结论 化学缺氧能使HSC MMP-2 mRNA表达上调，酶活性下降。HIF-1α可能参与了缺氧条件下MMP-2的表达调节。
【关键词】 肝纤维化; 缺氧；基质金属蛋白酶-2； 肝星状细胞； 缺氧诱导因子-1α
Hypoxia induced by CoCl2 influencing the expression and the activity of matrix metalloproteinase-2 in rat hepatic stellate cells FAN Ren-hua*, CHEN Ping-sheng, ZHAO Di, ZHANG Wan-dong. *Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Southeast University, Nanjing 210009, China
Corresponding author: CHEN Ping-sheng, Email: chenps@ seu.edu.cn
【Abstract】 Objectives To investigate the effects of hypoxia induced by cobalt chloride on the expression and the activity of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) in rat hepatic stellate cells (HSC-T6) and to clarify the possible mechanisms. Methods HSC-T6 cell line was grown in Dulbecco’s modified Eagle medium with 10% fetal calf serum at 37℃ and 5% CO2. When reaching confluence, the cells were incubated with serum-free medium in the presence of cobalt chloride (0, 50, 100, 200μmol/L) for six hours, and then the supernatant and the cells were harvested. The expression of the MMP-2 mRNA and HIF-1α protein in HSC-T6 cells was detected using RT-PCR and Western blot respectively. The activity of the MMP-2 in the supernatant was detected by zymography. The binding reaction between HIF-1α protein and MMP-2 gene sequence was investigated by electrophoresis mobility shift assay. Results When the concentration of CoCl2 increased from 0μmol/L to 200μmol/L, the expressions of MMP-2 mRNA (the rate of light density) were increased from 0.53±0.12 to 1.57±0.11 and the differences among these four groups were significant (F = 34.21, P < 0.01). The activity of MMP-2 (the value of light density×band area) decreased gradually from 84.49±5.38 to 53.70±3.42, and the differences among these four groups were also significant (F = 29.54, P < 0.01). The expressions of HIF-1α were increased gradually with the increase of the CoCl2 concentration. The shift band in the lane of the nuclear protein extraction and the MMP-2 probe containing hypoxia response element showed delays when compared with the lane of the sole probe, and the binding was partially abolished when competing sense oligonucleotides were used. Conclusions Our results suggest that chemical hypoxia can up-regulate the expression of MMP-2 mRNA and decrease the activity of the enzyme. HIF-1α may play a part in the regulation of MMP-2 transcription under hypoxic conditions.
【Key words】 Liver fibrosis; Anoxia; Matrix metalloproteinase-2; Hepatic stellate cell; Hypoxia inducible factor-1 alpha
肝纤维化是多数慢性肝病共同的病理学表现,HSC活化是参与其中的关键环节[1]。MMP-2可能通过降解Ⅳ型胶原改变细胞微环境而参与HSC活化和移行[2]。我们的前期研究结果显示物理性缺氧影响HSC MMP-2表达及酶活性[3, 4]。化学缺氧是否有类似效应尚不清楚，如果有影响，作为在哺乳动物细胞的低氧应答中居于核心地位的缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）是否参与了MMP-2表达调节亦有待阐明。
材料与方法
1. 细胞培养和缺氧诱导：大鼠HSC株（HSC-T6）来源于美国Friedman实验室，以2×105/ml细胞量接种于6孔塑料培养板中，用含10%优级胎牛血清的DMEM培养液培养于37℃、5% CO2、恒温、恒湿培养箱中。将细胞分成4组，每组3复孔。细胞成单层生长，形态为星形，不规则贴壁，细胞铺满孔底80%左右倾去完全培养基。各组分别加终浓度为0、50、100、200μmol/L的氯化钴（CoCl2）[5]无血清培养基于6孔板中，每孔1ml，继续培养6h，收集上清液离心，去沉渣，取上清液储存于-70℃冰箱保存备用，细胞用Trizol reagent，核蛋白裂解液分别提取总RNA和核蛋白。
2. RT-PCR检测MMP-2 mRNA表达：MMP-2、内参照β-actin引物由日本TaKaRa大连宝生物有限公司合成，Trizol reagent亦购自该公司。MMP-2引物：正义链：5′-ACCATCGCCCATCAT CAAGT-3′,反义链：5′-CGAGCAAAAGCATCAT CCAC-3′，扩增片段长度为328bp。内参照β-actin引物：正义链:5′-CGTCTGGACCTGGCTGGC CGGGACC-3′,反义链：5′-CTAGAAGCATTTGC GGTGGACGATG-3′，扩增片段长度为600bp。用Trizol reagent提取HSC-T6总RNA，取1μg进行逆转录。反应体系如下：RNAse free H2O 7.5μl，25mmol/L MgCl2 4μl，10×缓冲液2μl，dNTP 2μl，olige dT 1μl，AMV 1μl, RNAse inhibitor 0.5μl，RNA 1μg，补水至20μl，42℃反应60min，95℃ 5min；取4μl逆转录产物，依次加入5×缓冲液2.0μl，上下游引物各2.8μl，5U/μl Taq酶0.25μl，25mmol/L MgCl2 0.4μl，dNTP 0.4μl，加入灭菌的双蒸水至反应总体积20μl。扩增反应条件为：94℃ 3min，62℃ 50s, 72℃ 1min，共35个循环，72℃延伸10min；扩增产物在20g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳，并应用复日Smart生物电泳图像分析仪扫描，进行密度分析，半定量比较，以每个标本的目的条带与该标本β-actin条带密度的比值，作为该标本目的基因的相对表达量。
3. 明胶酶谱法检测MMP-2活性：参照文献[5]方法，用含1g/L明胶（购自美国Sigma公司）的8% SDS-PAGE浇制电泳板。等量的条件培养基加等量的加样缓冲液混合，上样。电压80～150V，电泳5～6h，取出凝胶，用1×Zymogram renaturation缓冲液漂洗2×15min, 1×Zymogram development缓冲液孵育过夜，以上加样缓冲液、复性液、孵育液均购自美国Bio-Rad公司，考马斯亮蓝G-250染色2h，脱色至蓝色背景有透明条带出现。MMP-2降解的明胶条带吸光度用Scio Image软件扫描，MMP-2活性大小用条带面积×吸光度表示。
4. 核蛋白抽提：本实验在缺氧操作箱中进行。用核蛋白抽提试剂NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（购自美国Pierce公司)裂解HSC-T6提取核蛋白，抽提方法参照试剂盒说明书，冰冷1×PBS冲洗细胞2次、沥干，按1×106细胞加100μl胞质裂解液CERⅠ,剧烈涡旋混匀15s，冰上孵育10min，加5.5μl CERⅡ，混匀5 s，冰上孵育1min，混匀5s，16000×g离心5min, 4℃, 取上清液储存于-70℃；重新悬浮未溶解的细胞碎片，加50μl CERⅢ，混匀15s，冰上孵育10min，重复此步4次，16000×g离心，10min, 4℃，立即取上清液即为所需核蛋白，储存于-70℃冰箱。
5. Western blot检测HIF-1α：核蛋白抽提物用8% SDS-PAGE电泳，然后将胶上蛋白转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉37℃封闭1h，1×PBST洗膜15min/次，4次，第一抗体（鼠源HIF-1α单克隆抗体购自美国Chemicon公司）1∶1000孵育4℃过夜，洗膜1h，第二抗体（HRP标记兔抗鼠第二抗体购自美国Santa Cruz公司）1∶2000,37℃孵育1h，洗膜1h，化学发光底物Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate（购自美国Pierce公司）孵育5min，暗室曝光，洗片。HIF-1α和β-actin的条带吸光度用Scio Image软件扫描，其表达量用条带面积×吸光度表示。
6. 荧光素酶报告基因分析：pGL3-promoter、pGL3-control、pSV-βgal购自美国Promega公司，分别由加拿大国家科学研究院生物研究所张万东博士和东南大学病理学与病理生理学系沈传陆教授惠赠。宿主菌E-coil DH5α由本实验室常规保存。中量质粒抽提试剂盒，脂质体Lipofectamin 2000购自美国Invitrogen公司，荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司，其余试剂购自日本TaKaRa大连宝生物有限公司。先合成MMP-2基因上含有缺氧应答元件（hypoxia response element, HRE）的一段寡核苷酸序列（23bp），克隆入pGL3-promoter，构建重组载体pGL3-mmp2。经测序鉴定，所克隆的基因片段与预期结果一致，序列无碱基突变。通过脂质体分别转染pGL3-mmp2、pGL3-promoter、pGL3-control到HSC-T6细胞，细胞培养24～48h后，用化学缺氧法（150μmol/L CoCl2）模拟缺氧状态6h，然后测定荧光素酶活性(LUC)。每组同时转染pSV-βgal作为内参照。以LUC与β-半乳糖苷酶荧光强度的比值代表各组荧光素酶活性强度，再以pGL3-promoter为基础算出各组荧光素酶活性升高的倍数（RLUC）。每组重复3次取平均值。
7. 统计学处理：实验数据用SPSS11.5统计软件处理，计量数据以x-±s表示，用单因素方差分析比较4组间总体差异，方差分析前行方差齐性检验。
结 果
1. MMP-2 mRNA表达：不同浓度的CoCl2条件培养基处理HSC-T6细胞6h，MMP-2 mRNA的表达呈剂量依赖性增加。4组间吸光度比值差异有统计学意义（F＝34.21，P<0.01，表1，图1，略）。
2. 不同缺氧条件下MMP-2活性：不同浓度的CoCl2条件培养基处理HSC-T6细胞6h后，MMP-2活性随着CoCl2浓度的增加，活性下降。4组间差异有统计学意义（F＝29.54, P<0.01，图2，表1，略）。
3. 不同缺氧条件下HIF-1α表达：Western blot检测实验显示随CoCl2浓度增加，HIF-1α表达量增大, 4种浓度CoCl2诱导表达的HIF-1α蛋白与β-actin蛋白二者的条带面积×吸光度比值分别为0.369、0.516、1.079、1.677（图3略）。
4. 荧光素酶活性：转染结果显示，将pGL3-promoter和pGL3-control转染到HSC-T6中，缺氧培养，LUC无明显差异，但转染pGL3-mmp2组LUC明显升高。荧光素酶活性平均值是空载质粒组的11.70倍，表2（略）。
表2 讨 论
肝纤维化是肝损伤持续存在、组织发生修复反应时因细胞外基质代谢失衡而引起的病理过程，是慢性肝病的重要病理特征，也是进一步向肝硬化发展的关键阶段[1，6]。MMP-2是细胞外基质主要降解酶之一，其基因表达和活性的调节是目前研究的热点，研究其表达调控机制有助于阐明肝纤维化发生的分子机制，从而找到疾病的源头，进而为防治肝纤维化提供新的靶点。HIF-1是一种转录因子，在哺乳动物细胞的低氧应答中居于核心地位,而低氧又与许多疾病的发生发展有关[7-9]，该转录因子的靶基因调控区均有与之结合的低氧反应元件。我们发现大鼠MMP-2基因5′调控区亦有相似序列，推测HIF-1可能参与了缺氧情况下MMP-2基因表达的调节。
本实验研究基于化学缺氧剂剂量准确可控、易操作等优点，以化学缺氧作为切入点观察MMP-2表达和酶活性变化规律，探讨HIF-1在其中的调节作用。RT-PCR检测MMP-2 mRNA的表达，结果显示其表达量呈剂量依赖性增加，而MMP-2活性随CoCl2浓度增加逐渐降低。提示缺氧可促进MMP-2基因转录，但同时抑制酶活化。在本组前期工作中亦发现物理性缺氧有上述效应[3]。Western blot检测HIF-1α表达，结果显示CoCl2低浓度时HIF-1α表达量呈剂量依赖性增加，在 CoCl2浓度为200μmol/L时 HIF-1α表达量达到最大，一方面说明不论是物理缺氧还是化学缺氧均可导致HIF-1α表达增加，另一方面也说明本研究成功地复制了缺氧模型。同时我们在预实验中还发现如果进一步增加CoCl2浓度，由于不良反应，细胞死亡明显增多，HIF-1α表达量亦随之下降。细胞在缺氧情况下，HIF-1α表达量增加，红细胞生成素、血管内皮生长因子、糖酵解酶等靶基因活动增强[10]，至于它是否调节MMP-2基因表达尚鲜见相关报道。本研究结果显示HIF-1α可与MMP-2片段结合，提示前者对MMP-2表达有一定调节作用。酶活性与MMP-2表达趋势正好相反，说明酶活性调节相关基因的活动也受缺氧的影响。但条带滞后程度不如EB病毒核抗原抽提物控制体系明显，可能存在的原因有：EB病毒核抗原抽提物控制体系核蛋白为纯化过的蛋白，而本实验所抽提核蛋白是一初提混合物；检测体系电泳时间偏短；HIF-1的活性亚基HIF-1α与结构性亚基HIF-1β在体外的结合与解聚亦是需要考虑的因素。
缺氧是组织细胞损伤的最常见原因，并有可能直接导致肝纤维化的发生发展[11]。在缺氧情况下基因表达调控以及蛋白质之间相互作用机制仍未完全搞清。化学缺氧模型有剂量准确可控、不要特殊设备、易操作等优点，本研究结果与我们前期用物理性缺氧所诱发的生物效应相似，可见CoCl2是一种比较好的化学缺氧诱导剂[12]。但机体缺氧多数情况下是因心肺功能不全或血管病变等引起，属物理性缺氧，若能在可控的缺氧培养箱中进行实验，所得结论应更有说服力。
本研究结果提示化学缺氧和物理缺氧一样能使HSC MMP-2 mRNA表达上调，同时酶活性下降。HIF-1α可能参与了缺氧条件下MMP-2的表达调节；然而酶活性下降的机制还有待进一步研究。HIF-1可能是一种潜在的防治肝纤维化的新靶点。
参 考 文 献
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