【摘要】 目的 观察罗格列酮对NASH肝纤维化大鼠肝组织kruppule样因子（KLF）6及其下游靶基因TGFβ1信号通路的影响。方法 36只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、高脂组和罗格列酮组，24周末处死所有大鼠，留取肝组织行HE和Massson染色，检测血清TG、游离脂肪酸、AST、ALT及HA、LN、CⅣ等，RT-PCR检测核转录因子KLF6、TGFβ1以及反映HSC活化的特异性标记α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA的变化，免疫组织化学检测KLF6、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、α-SMA的蛋白表达。结果 模型组大鼠24周末出现典型脂肪性肝纤维化，治疗组纤维化程度明显减轻和改善。模型组血清生物化学指标及肝纤维化指标均有不同程度增高，罗格列酮干预16周后上述各指标均见明显改善，两组间差异有统计学意义（P＜0.01）。RT-PCR显示模型组KLF6 mRNA（0.96±0.08）、TGFβ1 mRNA（0.91±0.07）和α-SMA mRNA（1.08±0.19）的相对表达量均明显上升，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；治疗组则显示增高的上述基因呈不同程度的下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。免疫组织化学显示罗格列酮组KLF6、α-SMA蛋白的表达较模型组减少，而PPARγ的表达较模型组增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结论 罗格列酮可以激活PPARγ，降低NASH肝纤维化大鼠肝组织核转录因子KLF6及其下游靶基因TGFβ1的表达，抑制HSC的活化，阻止肝纤维化形成，这可能是其发挥抗肝纤维化的作用之一。
【关键词】 肝纤维化； 罗格列酮； Kruppule样因子
Effects of rosiglitazone on Kruppul-like factor 6(KLF6) signaling in the livers of rats with nonalcoholic fatty liver fibrosis WANG Xiao-min*, CHEN Dong-feng. *Xinjiang Uigur Autonomous Region People’s Hospital, Urumchi 830001, China
Corresponding author: CHEN Dong-feng, Email:dfchen9@ hotmal.com
【Abstract】 Objective To study the effects of rosiglitazone on Kruppule-like factor 6 (KLF6) and its target gene TGF 1 during the development of nonalcoholic fatty liver fibrosis. Method Thirty-six Wistar rats were divided into three groups: a control group, a high fat model group and an intervention group. Their blood serum TG, FFA, AST, ALT, HA, LN and CIV were measured. Hepatic expressions of KLF6, TGFβ1 and α-SMA were detected by RT-PCR and immunohistochemistry. The pathological features and the degree of liver fibrosis before and after the rosiglitazone intervention were also studied. Results The contents of TG, FFA, AST, ALT, HA, LN and CIV, the expression of KLF6, TGFβ1 and α-SMA mRNA, and the degree (score) of liver fibrosis at the 24th week in the model group were significantly higher than those in the control group (P < 0.01) but they were lower in the rosiglitazone intervention group (P < 0.05). The protein expression of α-SMA was also lower in the intervention group compared with that of the model group. Conclusion Rosiglitazone, to a certain extent, can inhibit KLF6-TGF 1 signal transduction by inducing expression of PPARγ, and then inhibit the activation of hepatic stellate cells and minimize hepatic fibrosis.
【Key words】 Liver fibrosis; Rosiglitazone; Kruppule-like factor
目前，尚无治疗NASH的特效药物，初步临床研究显示，罗格列酮治疗NASH有效[1]，但其确切作用机制尚不清楚。我们的前期研究结果显示KLF6介导的TGFβ1信号通路在脂肪性肝炎、肝纤维化形成过程中发挥重要用[2]，且其在肝组织的表达与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators response element gamma，PPARγ）有一定的相关性，因此，本实验通过给予高亲和力的PPARγ的人工合成配体罗格列酮，研究其对kruppule样因子（KLF）6-TGFβ1信号通路的影响，进一步探讨该药的抗炎、抗肝纤维化机制。
材料与方法
一、材料
胆固醇和胆盐购自重庆市医药公司生化试剂公司。罗格列酮由重庆太极集团制药公司馈赠。HA、LN、CⅣ放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所，Tripure购自上海罗氏公司，RT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司，α-SMA小鼠单克隆抗体购自武汉博士德公司，兔抗大鼠KLF6多克隆抗体、小鼠抗大鼠PPARγ单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。
二、方法
1. 动物模型及分组：雄性Wistar大鼠36只购自第三军医大学实验动物中心，体重180～200g。正常喂养1周后，随机分为3组。对照组12只以普通饲料喂养，模型组12只以2%胆固醇＋15%猪油＋0.5%胆盐＋82.5%普通饲料构成高脂饲料喂养。罗格列酮干预组于高脂喂养8周后给予罗格列酮4mg?kg-1?d-1干预。24周末以速眠新1ml/kg麻醉大鼠，腹主动脉采血，肝右叶中部切取2块肝组织，1块1.0cm×0.5cm×0.5cm大小，用4%多聚甲醛溶液固定制备石蜡切片，另1块0.5cm×0.5cm×0.5cm大小置于－70℃冰箱储存，用于RT-PCR检测。
2. 血清学指标：血清TG、游离脂肪酸（FFA）、ALT、AST采用全自动生物化学分析仪检测。放射免疫法检测血清HA、LN、CⅣ，严格按试剂盒说明书进行操作。
3. 组织病理学：4%多聚甲醛溶液固定肝组织，石蜡包埋，常规HE染色，病理分级分期参照文献[3]。
4. 免疫组织化学：肝组织石蜡切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，PBS洗3次，pH8.0的EDTA微波修复，滴加第一抗体（α-SMA、PPARγ稀释浓度为1∶50，KLF6稀释浓度为1∶100）后4℃过夜，次日滴加第二抗体，37℃孵育1h后DAB显色，经苏木素复染，稀盐酸乙醇分色后封片观察，每次实验均设阴性对照，以PBS代替第一抗体。每例均随机观察5个高倍视野，读取阳性细胞数。
5. KLF6、TGFβ1、α-SMA mRNA检测：肝组织总RNA的提取。按Tripure试剂盒说明进行操作，最后加入DEPC去离子水20μl重新溶解RNA，待用。RNA样品的纯度根据260nm及280nm吸光度值的比值（A260/280）来计算，比值为1.8～2.0。RNA样品的电泳鉴定：用10g/L甲醛变性琼脂糖凝胶，10μg RNA样品电泳，紫外光照射下观察，如28S、18S、5S rRNA带清晰可见，带与带之间无明显脱尾则表明RNA无明显降解，可用于RT-PCR分析。
6. 引物设计：KLF6上游引物为5′-TGCCT GGAGTTGGAACGCTATC-3′，下游引物为5′-TGCTTTCGGAAGTGTCTGGTC-3′，扩增片段656bp；TGFβ1上游引物为5′-ACCGCAACAAC GCAATCTATG-3′，下游引物为5′-ATTCCGTC TCCTTGGTTCAGC-3′，扩增片段298bp；α-SMA上游引物为5′-AGGGACTAATGGTTGGAA TGG-3′，下游引物为5′-CAATCTCACGCTCGG CAGT AG-3′，扩增片段为504bp；内参照β-actin上游引物为5′-GCTGTGCTATGTTGCCCTAGACT-3′，下游引物为5′-CGGACTCATCGTACTCCT GCTTG-3′，扩增片段452bp。
7. RT-PCR检测：反应分两步进行，取总RNA 5μg，在AMV逆转录酶作用下逆转录为cDNA，以此为模板，分别按以下条件进行PCR反应，扩增KLF6：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，最后72℃延伸10min。扩增TGFβ1和α-SMA：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物5μl在20g/L琼脂糖凝胶上进行电泳。凝胶电泳后，于Gel Doc2000凝胶图像分析系统进行扫描，用BandScan软件分析，测定产物条带的吸光度值，以β-actin为基准，做半定量分析，即以扩增目的片段/β-actin的灰度值表示所扩增目的基因片段的相对表达水平。
三、统计学处理
实验数据采用SPSS10.0统计软件处理，组间差异采用单因素方差分析（one-way ANVOA），等级资料采用秩和检验。
结 果
一、肝组织HE和Masson染色
光镜下对照组肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞形态规则，细胞质丰富，细胞核圆形；高脂喂养24周模型组肝细胞高度气球样变，以腺泡3带明显，腺泡内点状坏死、门管区轻至中度炎症，广泛的窦周纤维化和门管区星芒状纤维化，少数见桥接纤维化（图1，表1略）；罗格列酮干预组肝组织炎症及肝纤维化程度明显减轻（图2，表2略）。
二、罗格列酮对血清TG、FFA及肝功能指标的影响
模型组大鼠血清TG、FFA、AST、ALT等均较对照组显著增高，差异均有统计学意义（P<0.05）；罗格列酮干预组上述指标均见不同程度下降，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），且与对照组相比两组间差异仍有统计学意义（P<0.05，表3）。
三、罗格列酮对血清肝纤维化指标的影响
高脂喂养模型组血清HA、LN、CⅣ等均较对照组显著增高，差异有统计学意义（P<0.01）。罗格列酮干预组上述指标均见不同程度下降，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。且与对照组相比两组间差异仍有统计学意义（P<0.05，表4）。
表4（略） 四、肝组织中α-SMA、KLF6、PPARγ的免疫组织化学染色
1. α-SMA的免疫组织化学染色：对照组大鼠肝组织α-SMA只分布于血管壁平滑肌，模型组汇管区、纤维间隔和Disses间隙阳性细胞数增多且染色深。罗格列酮干预组除血管平滑肌表达外，靠近中央静脉和窦周处可见散在少量α-SMA表达，染色浅。
2. KLF6的免疫组织化学染色：对照组未见KLF6阳性染色，模型组脂肪变性的肝细胞核呈棕黄色阳性表达（图3略），罗格列酮干预组肝细胞核染色变浅，阳性染色细胞数较模型组明显减少（图4略）。
3. PPARγ的免疫组织化学染色：对照组可见适量PPARγ阳性染色，模型组仅见少量脂肪变性的肝细胞核呈棕黄色染色，且纤维形成部位PPARγ阳性染色明显减少（图5略），罗格列酮干预组阳性染色细胞有所增加，细胞核呈棕褐色染色（图6略）。
4. 罗格列酮对大鼠肝组织α-SMA、KLF6、PPARγ阳性表达率的影响见表5。
五、肝组织中KLF6、TGFβ1、α-SMA mRNA的变化
模型组大鼠肝组织KLF6、TGFβ1、α-SMA mRNA表达与对照组比较均见明显增高，两组间差异有统计学意义（P<0.01），罗格列酮干预组与模型组比较表达均见下降，两组间比较差异有统计学意义（P<0.05），且与对照组相比两组间差异仍有统计学意义（P<0.05）（表6，图7～9，略）。
讨 论
罗格列酮是PPARγ的高效激动剂，其经典的作用机制是作为配体与PPARγ受体结合，在肝脏脂类代谢和炎症反应中发挥重要作用[4]。尽管目前PPARγ配体发挥抗炎抗纤维化作用机制尚不清楚，但一些学者认为这与PPARγ激活从而抑制多种应激立早基因如应激激酶、活化蛋白（AP1）、核转录因子-κB等介导的应激反应有关[5-7]。KLF6基因是一种损伤后立即早期基因，脂肪酸氧化功能受损以及脂肪分泌的激素可明显使其激活，反式作用于其下游靶基因TGFβ1及其受体，参与肝纤维化形成过程[8]。
我们的研究发现，给予罗格列酮干预16周后，大鼠肝组织脂肪变性、炎细胞浸润以及肝纤维化程度较高脂模型组均见明显减轻，血清学指标亦有不同程度的改善。大鼠肝组织KLF6、TGFβ1、α-SMA mRNA表达与高脂模型组比较明显下降，两组间差异有统计学意义；同时PPARγ的蛋白表达与高脂模型组相比明显增加，而KLF6、α-SMA的蛋白表达却明显降低，提示罗格列酮可通过激活PPARγ而抑制应激基因KLF6的表达，从而在转录水平降低其下游促纤维生成因子TGFβ1的表达，抑制HSC的激活而减轻NASH肝纤维化的形成。Wang等[9]通过体外研究发现当给予活化的HSC外源性PPARγ激动剂后，活化的HSC数目明显减少，提示PPARγ的高表达可部分逆转活化的HSC，从而减缓肝纤维化的发生发展。我们的体内实验同样证实PPARγ高效激动剂罗格列酮可通过对KLF6-TGFβ1信号通路及HSC活化的抑制作用，明显改善高脂饮食诱导的NASH大鼠血清酶学指标、纤维化指标以及肝组织学指标，这为临床应用PPARγ激动剂治疗非酒精性脂肪性肝病提供了一定的理论依据。
参 考 文 献
[1]Neuschwander-Tetri BA, Brunt EM, Wehmeier KR, et al. Improved nonalcoholic steatohepatitis after 48 weeks of treatment with the PPAR-gamma ligand rosiglitazone. Hepatology, 2003, 38: 1008-1017.
[2]Wang XM, Chen DF. Role of kruppel-like factor 6 in the development of nonalcoholic fatty liver fibrosis in rats. Xiaohua Waike Zazhi, 2006, 5: 355-360.
王晓敏，陈东风.核转录因子KLF6在非酒精性脂肪性肝纤维化形成中的作用.消化外科,2006,5:355-360.
[3]Fatty Liver and Alcoholic Liver Disease Study Group of the Chinese Liver Disease Association. Guidelines for diagnosis and treatment of nonalcoholic fatty liver diseases. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2006, 14: 161-163.
中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南.中华肝脏病杂志,2006,14:161-163.
[4]Hammarstedt A, Andersson CX, Rotter Sopasakis V, et al. The effect of PPARgamma ligands on the adipose tissue in insulin resistance. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 2005, 73: 65-75.
[5]Singh N, Webb R, Adams R, et al. The PPAR-gamma activator, Rosiglitazone, inhibits actin polymerisation in monocytes: involvement of Akt and intracellular calcium. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 333: 455-462.
[6]S醤chez-Hidalgo M, Mart AR, Villegas I, et al. Rosiglitazone, an agonist of peroxisome proliferator-activated receptor gamma, reduces chronic colonic inflammation in rats. Biochem Pharmacol, 2005, 69: 1733-1744.
[7]Abdelrahman M, Sivarajah A, Thiemermann C. Beneficial effects of PPAR-gamma ligands in ischemia-reperfusion injury, inflammation and shock. Cardiovasc Res, 2005, 65: 772-781.
[8]Gehrau RC, D'Astolfo DS, Prieto C, et al. Genomic organization and functional analysis of the gene encoding the Kr黳pel-like transcription factor KLF6. Biochim Biophys Acta, 2005, 1730: 137-146.
[9]Wang L, Potter JJ, Rennie-Tankersley L, et al. Effects of retinoic acid on the development of liver fibrosis produced by carbon tetrachloride in mice. Biochim Biophys Acta, 2007, 1772: 66-71.
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