【关键词】 小鼠； 肝细胞； 腺病毒； RNA干扰； Fas受体
Recombinant adenovirus vector with Fas (CD95)-targeted shRNAs inhibited LPS-inducing Fas overexpression of mouse hepatocytes LIU Ming-she, ZHAO Zhong-fu, WANG Lan, ZHANG Guo-ying, ZHANG Yun, YANG Hui, QIAO Jing-gui, HAN De-wu.
【Key words】 Mice; Hepatocyte; Adenovirus; RNA interference; Fas receptor
【First author's address】 Institute of Hepatology, Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China
Corresponding author: ZHAO Zhong-fu, Email: zhaozf_1226@ 163.com
肝细胞Fas抗原表达与肝细胞的炎症活动度有关。有人通过阻断Fas信号引起的肝细胞过度凋亡，以探讨治疗肝脏疾病的新方法[1]。RNA干扰（RNAi）技术是有效的基因沉默工具，我们通过腺病毒Fas-shRNA串联表达载体感染小鼠，观察其对LPS诱导小鼠肝细胞Fas过度表达的抑制效应。
一、材料与方法
1. 试剂：LPS购自美国Sigma公司；D-氨基半乳糖（D-GalN）购自重庆医科大学生物化学工程学院；兔抗鼠Fas（C-端多肽）多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；DNA梯带标准80购自日本TaKaRa Bio株式会社（大连）；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；Fas shRNA腺病毒pAdeno-X-siFas1+siFas2载体由武汉晶赛公司协助构建。
2. 动物：20只雄性BALB/c鼠，4～8周龄，体重20～25g，清洁级，由山西医科大学动物实验中心提供。
3. 动物分组：20只BALB/c鼠随机分为RNAi组、腺病毒通用阴性对照组、模型组和正常对照组，每组5只。RNAi组每只鼠经尾静脉注射108pfu/ml pAdeno-X-siFas1+siFas2 1ml、 2次，间隔24h；阴性对照组尾静脉注射阴性pAdeno-X-HK 108pfu/ml；模型组注射等量等渗盐水；上述3组24h后每只鼠腹腔注射LPS 5μg/kg（0.25μg/ml 0.5ml)+D-GalN 400mg/kg（20mg/ml 0.5ml），预试验结果表明，该剂量组合4h后可以诱导小鼠肝细胞出现凋亡，并有Fas表达增强；8h后凋亡增多，伴有淤血。正常对照组在各时间点注射等量等渗盐水。注射LPS+D-GalN 8h后，1%戊巴比妥钠麻醉并处死，取肝脏，备检。
4. 腺病毒载体转染率检测：小鼠肝脏作5μm冰冻切片，在Olympus荧光显微镜下随机选择5个视野，计数发绿色荧光的肝细胞数和相应视野的肝细胞总数，计算转染率。
5. Fas蛋白表达的Western blot检测：以β-actin作为内参照，操作按说明书进行。对显色后的聚偏氟乙烯膜数码摄像，经Image pro plus 5.0软件分析累积吸光度（IOD）值，以IOD比值（Fas IOD值/β-actin IOD值）代表Fas蛋白的表达强度。
6.肝组织Fas mRNA表达的RT-PCR检测：按Trizol试剂说明书，从肝组织中提取总RNA。用RT-PCR扩增鼠 Fas mRNA目的片段419 bp，引物序列参见文献[2]。以鼠β-actin mRNA扩增目的片段81bp，引物序列参见文献[3]。PCR反应条件：95℃ 3min；95℃ 30s，58℃ 45s， 72℃ 45s，循环35次；72℃延伸3min。扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外光下采集DNA条带图像进行IOD值分析。
7. 肝细胞凋亡的DNA梯带检测：酚、氯仿提取肝组织DNA，琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯带。
8. 统计学分析：数据以x-±s表示，采用SPSS13软件进行方差分析和t检验。
二、结果
1. 腺病毒载体对鼠肝细胞的转染率：各组间的转染率差异无统计学意义，合并计算转染率为78.49%±1.01%（图1）。
2. Fas蛋白表达的Western blot结果：不同处理组间Fas表达差异有统计学意义（F＝458.046, P＜0.01）。RNAi组Fas表达明显低于模型组与阴性对照组（P＜0.01），接近于正常水平，后两组间Fas表达差异无统计学意义（图2）。
3. Fas mRNA表达的RT-PCR结果：419bp的条带为Fas mRNA扩增片段，81bp的条带为β-actin mRNA扩增片段（图3）。RNAi组与阴性对照组和模型组间差异有统计学意义（t＝22.703和t＝23.481，P＜0.01）。
4. DNA梯带电泳结果：注射LPS+D-GalN 8h后，除正常组外各组均出现DNA梯形带（图4）。
三、讨论
一般认为质粒载体用于体内转染效果不理想，而腺病毒载体是一种高效的体内转染载体[4]。我们应用携带Fas-shRNA表达框的腺病毒载体，经鼠尾静脉注射，达到了有效转染肝细胞的目的。
在病毒性肝炎的发生发展过程中，肝细胞Fas蛋白过度表达[5]。过度表达的Fas蛋白与其配体FasL结合诱导细胞过度凋亡，造成肝损伤。抑制病理状态下肝细胞Fas蛋白的过度表达，防止肝损伤具有重要的治疗意义。有研究表明，对一个靶基因用多位点RNAi技术能够增强基因沉默的效果。我们应用携带2个Fas-shRNA表达框的腺病毒载体pAdeno-X-siFas1+siFas2经尾静脉注射，有效抑制了LPS+D-GalN诱导的小鼠肝细胞Fas表达。
然而，细胞凋亡的DNA梯带检测结果显示，腺病毒载体RNAi对Fas表达的抑制作用，并不能完全阻止LPS+D-GalN诱导的细胞凋亡。提示Fas信号不是LPS诱导肝细胞凋亡的惟一途径, 这一结果与文献[6]报道一致。
参 考 文 献
[1]Song E, Lee SK, Wang J, et al. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nat Med, 2003, 9: 347-351.
[2]Zhang M, Liu F, He W, et al. Inhibition of Fas-mediated apoptosis in Yac-1 cell via Anti-Fas ribozyme. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2004, 36: 199-205.
[3]Hulzebos CV, Wolters H, Plosch T, et al. Cyclosporin a and enterohepatic circulation of bile salts in rats: decreased cholate synthesis but increased intestinal reabsorption. J Pharmacol Exp Ther,2003, 304: 356-363.
[4]Vorburger SA, Hunt KK. Adenoviral gene therapy. Oncologist, 2002,7: 46-59.
[5]Qin B, Zhang DF, Ma Y, et al. Role of tumor necrosis factor receptor 1 and Fas antigen in hepatcellular apoptosis of viral hepatitis B patients. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2001, 9: 337-339.
秦波,张定凤,马英,等.肿瘤坏死因子受体和Fas在乙型肝炎肝细胞凋亡中的意义.中华肝脏病杂志,2001,9:337-339.
[6]Josephs MD, Bahjat FR, Fukuzuka K, et al. Lipopolysaccharide and D-galactosamine-induced hepatic injury is mediated by TNF-alpha and not by Fas ligand. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2000, 278: R1196-1201.
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