【关键词】 干细胞, 骨髓； 肝再生；肝切除术
Effects of human bone marrow mesenchymal stem cell transplantation into rats with liver regeneration failure TAN Hao-xiang, GAO Yi, CHEN Jiang-feng.
【Key words】 Stem cells, myeloid; Liver regeneration; Hepatectomy
【First author's address】 Department of General Surgery,Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510280, China
Corresponding author: GAO Yi, Email: gaoyi6146@ 163.com
骨髓间充质干细胞（MSCs）具有可塑性，包括可以向肝细胞分化的能力[1]。目前诱导MSCs向肝细胞分化的体内外相关实验研究已经由动物向人MSCs过渡[2-4]。基于人MSCs的人体内实验则较为少见，具体机制尚不明了[5，6]。因此本实验将人MSCs移植入大鼠肝衰竭模型，对其体内变化机制进行观察。
一、材料与方法
1．材料: SPF级F344大鼠30只，雌雄不拘，体重150～250g购自中山医科大学动物中心，Percoll细胞分离液购自美国Pharmacia公司、低糖细胞培养基（L-DMEM）购自美国Sigma公司、胎牛血清购自美国hyclone公司、鼠抗人CD29-PE、CD34-PE、CD44-PE、CD45-FITC均购自美国Pharmingen公司、兔抗人AFP抗体购自美国Neomarkers 公司、生物素化山羊抗兔IgG购自武汉博士德公司、PCR引物设计、分子量标准、PCR试剂盒均购自大连TaKaRa公司。
2．方法：（1）人MSCs的获取与鉴定：取临床无血液疾病志愿者髂骨内骨髓，密度梯度离心法分离与贴壁法分离培养人MSCs。取第3代人MSCs分4组，流式细胞仪检测表面标记。（2）动物分组：随机分为3组每组10只。A组：单纯80%肝切除；B组：80%肝切除+DMEM；C组：80%肝切除术+人MSCs移植。（3）细胞移植：自门静脉注入0.5ml细胞悬液含人MSCs约1×107个。（4）肝功能检测：各组于术前及术后12h、3d、7d、12d、14d取眼眶静脉血1ml测ALT、AST、TBil值。（5）人AFP免疫组织化学染色：各组于术后3d取肝组织，sABC法染色。以人肝组织AFP表达为阳性对照。（6）PCR检测大鼠肝组织中人Alu-sx与大鼠Sox11序列DNA表达：各组术后14d取肝组织5g提取DNA。人Alu-sx引物S: 5′-GGCGCGGTGGCTCACG -3′，A: 5′-TTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTC-3’，扩增物长度282bp。大鼠Sox11引物S：5′-TCGTGGCGG TCAGGATAAA-3′，A：5′-AGTTGTGCCGTCTA AAGGGTC-3′，扩增物长度437bp，分子量标准：1400bp。以人肝脏组织为阳性对照。
二、结果
1. 人MSCs的生长与表型鉴定：第三代人MSCs CD29阳性率为95.3%，CD44阳性率为94.7%，CD34阴性率为98.2%，CD45阴性率为99.2%。
2. 大鼠肝功能检测：术后A、B组肝功能于术后7d好转，术后14d肝功能不能完全恢复，C组术后3d好转，12d后肝功能恢复正常，C组与A、B组间肝功能差异有统计学意义（P＜0.01），各时段肝功能指标，见表1～3。
3. 各组肝组织中人AFP的表达：术后3d检测人AFP表达，发现人AFP在胞浆中染成棕色，A、B组人AFP为阴性表达，C组为弱阳性表达，见图1。
4. 各组肝组织中Sox11与Alu-sx序列DNA的表达：术后14d检测A、B组仅有Sox11序列表达，C组同时有Sox11与Alu-sx序列表达，见图2。
三、讨论
MSCs与肝再生关系密切，肝损伤后机体有三种细胞参与肝脏再生，即成熟肝细胞、肝卵圆细胞与自体MSCs。自体MSCs肝特定微环境下诱导下趋化到相应部位，定向分化为肝前体细胞和肝细胞，具有强大的更新能力[7]。但由于成熟肝细胞具有体外培养与扩增困难、肝卵圆细胞因数量少不易获取等缺陷，MSCs相对具有容易获取，体外培养与富集比较简单，以及免疫原性低等优势，因此当肝脏过度损伤导致参与再生的自身三类干细胞都不能完全代偿时，移植异体MSCs将有可能替代自体干细胞进行肝再生。此外异体MSCs在替代过程中还需要有足够的时间用于定向分化。有报道人MSCs体外向肝细胞分化需5～14d[8]，王韫芳等[3]与吴雄志等[4]报道动物MSCs体内向肝细胞分化需3～5d。
大鼠70%肝切除术后14d残肝再生可恢复到正常大小，而切除90%则为极限体积术后平均生存时间仅12h，提示在70%～90%体积间的肝切除，自体干细胞从动员到完全修复的肝再生过程必然要超过14d。因此本实验选择80%肝切除模型，用来观测人MSCs移植后的变化，不但为人MSCs提供充裕的分化时间，而且通过肝功能恢复时间长短判断人MSCs是否发挥作用。
实验发现移植人MSCs术后第3天开始有人AFP的表达，同时肝功能在第3天好转，第12天恢复正常，术后14d在大鼠肝组织内仍有人特异性序列Alu-sx的表达，提示人MSCs在大鼠体内不但已经向肝细胞分化并发挥一定功能，而且还可以在大鼠体内持续存活。提示人MSCs在人体内也有可能具有相同的机制。
参 考 文 献
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王韫芳,南雪,尉承泽,等.丙烯醇致肝损伤微环境定向诱导骨髓干细胞向肝细胞分化.中华肝脏病杂志,2005,13:274-277.
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吴雄志,赵连三,许倩, 等.骨髓间充质干细胞在肝部分切除模型小鼠体内向肝细胞分化.生物医学工程学杂志,2005,22:1234-1237.
[5]Yao P, Hu DR,Wang S, et al. Treatment of severe liver damage with autologous bone marrow stem cell transplantation in human patients. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 941-942.
姚鹏,胡大荣,王帅,等.自体骨髓干细胞移植治疗慢性肝衰竭研究.中华肝脏病杂志,2005,13:941-942.
[6]Sato Y, Araki H, Kato J, et al. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion. Blood, 2005, 106: 756-763.
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[8]Zhao WJ, Chen YJ, Zhao ZG, et al. A study of AFP and ALB expression in human mesenchymal stem cells induced by hepatopathy patient serum. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2006, 14: 300-301.
赵文静,陈亚洁,赵振国,等.肝病患者血清诱导人骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白的实验研究.中华肝脏病杂志,2006,14:300-301.
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