【摘要】目的研究胆管上皮细胞(biliary epithelia cells，BECs)增生在胆管结扎(bile duct ligation,BDL)大鼠胆汁性肝纤维化形成中的作用。方法BDL的方法制作大鼠胆汁性肝纤维化模型，5周后杀鼠取材，观察内容包括大鼠血清总胆红素（TBlL）、总胆汁酸（TBA），肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量，组织病理学，免疫组织化学观测Ⅰ型胶原(Col I) 、IV型胶原(Col IV)、层粘蛋白(LN)、纤连蛋白(FN)和α平滑肌肌动蛋白（αSMA）；肝组织片激光显微切割（LCM）获取BECs，实时荧光定量PCR检测BECs表达Procollagen α1(Ⅳ) 、血小板衍生生长因子B (PDGFB)、结缔组织生长因子(CTGF)及转化生长因子β1(TGF-β1) mRNA。结果1、胆管结扎模型大鼠血清TBiL和 TBA含量均值分别为假手术组大鼠的22倍和3倍（P<0.01）；模型组大鼠肝组织Hyp含量是假手术组的4倍（P<0.01）；2、模型组大鼠BECs增生非常显著，肝实质细胞比例显著减少；3、模型组大鼠在增生胆管周围的LM表达显著增加；FN不但在肝窦内有阳性染色，还强烈地表达于增生的胆管周围；肝窦壁的Col I阳性染色增强，增殖的BECs周围未见明显阳性染色；肝窦壁Col Ⅳ表达未见明显变化，但强烈表达于增殖的BECs周围的基底膜上；αSMA阳性染色见于汇管区周围的肌成纤维细胞上，且这些肌成纤维细胞常常围绕在增生的胆管上皮细胞周围。4、模型组大鼠BECs的Procol α1(Ⅳ)、PDGFB、TGF-β1及CTGF的mRNA表达量均显著增加 （与假手术组比较，均为P<0.001）。结论BECs增生是BDL大鼠胆汁性肝纤维化的启动因素和中心病理环节，抑制胆管上皮细胞的异常增生及其细胞生物学病理变化应是抗胆汁性肝纤维化治疗学研究的主要目标。
【关键词】胆管结扎； 胆汁性肝纤维化； 胆管上皮细胞； 增生 The role of cholangiocytes proliferation in the formation of hepatic fibrosis in BDL rats.WANG Bin， LIU Ping, LONG Aihua, et al.on Pathologic Laboratory,Tianjin First Centre Hospital, Tianjin 300192, China
【Abstract】ObjectiveTo study the role of biliary epithelia cells (BECs) proliferation in BDL indused hepatic fibrosis in rats.MethodsAll rats were sacrificed after 5 weeks seram. Samples were obtained and liver tissue hydroproxyline (Hyp) content detected, histopathological examination were performed; Cholangiocytes were obtained by laser capture microdissection(LCM). Procollagen α1(Ⅳ), PDGFB, CTGF and TGF-β1 mRNA expressions in cholangiocytes were assayed by real time PCR.Results1. TBiL and TBA content in model group were 22 and 3 folds that of sham operation group（P<0.01）; 2. Hyp content in model group was 4 folds that of sham operation group（P<0.01）; 3. Cholangiocytes in model group proliferated significantly and liver parenchymal cells decreased proportionally; LN expression around bile ductule in model group enhanced significantly, FN expressed not only in sinusoidal area, but also around the proliferated biliary ductule. No significant change of Col Ⅳ staining was seen in sinusoidal wall but enhanced expression was seen around basement of proliferating cholangiocytes in model rats, αSMA staining was seen in fibroblast cells around periportal area in model group, these fibroblast cells usually appeared around cholangiocytes. 4. Procollagen α1(Ⅳ), PDGFB, TGF-β1 and CTGF mRNA expression in cholangiocytes increased significantly in model group compared to that in sham operation group (P<0.001).ConclusionBiliary epithelia cells proliferation is the initiater and central pathological link in BDL hepatic fibrosis in rats. Inhibiting BECs proliferation and cells biological characterestics should be the targets of preventing biliary hepatic fibrosis.
【Key words】Bile duct ligation; Biliary hepatic fibrosis; Cholangiocyte ; Proliferation
本文采用大鼠BDL模型，对胆管上皮细胞(BECs)在胆管结扎(BDL)大鼠胆汁性肝纤维化形成中的作用进行深入研究。
材料与方法
一、主要材料
SD大鼠30只，雄性，清洁级，体重200±15 g，购自中国科学院上海实验动物中心。硬化剂采用医用TH黏合剂，广州白云医用胶公司产品；羟脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）标准品，购自日本ナカラィテスク株式会社。
二、动物模型制备
沿腹正中线切开，暴露胆总管，逆行向肝门部注入硬化剂，远近端结扎胆总管，中间剪断，关腹。假手术仅开腹并游离胆总管后关腹。造模5周后杀鼠取材。
三、肝组织学观察
(一) 常规标本HE染色，胶原纤维天狼猩红染色，光镜下观察。
(二) 免疫组织化学染色两步法检测肝组织Col I 、Col IV、LM、 FN和αSMA，光镜下观察，采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统,免疫组化染色切片每组各取3张，随机选择5个不同视野，在20×10放大倍数下，测定计算阳性区域与标准测量窗口的面积比。
(三) 常规电镜标本半薄切片定位后，超薄切片，H600透射电镜观察。
(四) BECs显微切割（laser capture microdissection）LCM显微切割仪是在直接光学显微观察的基础上，利用激光能量对特定的组织或细胞类型进行切割，同时用激光脉冲所产生的压力把切割后的目的样品弹射（catapult）到收集帽（cap）中富集，获得均一性的样品。
(五) BECs总RNA提取。
(六) 实时荧光定量PCR检测BECsProcollagen α1(Ⅳ) 、PDGFB、CTGF及TGF-β1 mRNA的表达量。使用Sensiscript RT Kit进行反转录。引物由本研究所设计，上海生工公司合成。
(七) 统计学处理计量资料用计算机统计分析软件SPSS11.5中的ANOVA程序进行单因素方差分析，并用LSD或Tambane进行两两比较。
结果
一、胆管阻塞大鼠血清TBiL、TBA含量的变化
与假手术组比较，模型组血清TBil含量显著增高（P<0.01），其均值为假手术组大鼠的22倍；与假手术组比较，模型组血清总胆汁酸(TBA)含量显著增高（P<0.01）。表1（略）
HE染色显示假手术组大鼠肝小叶结构清晰，模型组（5周）大鼠肝脏内小胆管大量增生，以汇管区为中心放射状向肝实质内延伸，增殖的胆管呈花环样，BECs周围有肌成纤维细胞的聚集和细胞外基质的沉积；炎症及坏死均不明显，肝细胞的形态结构尚正常（见图2A略）。
天狼猩红染色：假手术组仅在汇管区和中央静脉壁见少量胶原纤维。模型组大鼠胆管大量增生，大量的细胞外基质沉积在增殖的BECs周围，以汇管区为中心向肝实质内延伸；肝实质内有少量的细胞外基质沉积。增生的小胆管及其周围的胶原纤维形成间隔，与临近增生的间隔互相连接、包绕、分割，改建原来的肝小叶而形成假小叶。在胆小管增生严重的区域，已见不到大的肝细胞团块，虽然肝纤维化很严重，却见不到较典型的假小叶形成（见图2B略）。
三、透射电镜观察肝组织超微结构变化
假手术组大鼠肝内胆管正常，无淤胆，BECs周围少有成纤维细胞的聚集，胆管腔内微绒毛较多。模型组大鼠肝组织内可见大量的胆管增生，围成典型的管腔，肝细胞和增生的BECs胞浆内淤胆，管腔内有较多的胆栓形成，微绒毛减少，BECs周围有大量的胶原纤维沉积和大量的成纤维细胞聚集（见图3略）。
四、免疫组织化学观察（见图4略）
Ⅰ型胶原：假手术组在血管壁有轻度阳性染色。模型组大鼠肝组织实质内则阳性染色增强，增殖的BECs周围未见明显阳性染色。
Ⅳ型胶原：假手术组大鼠肝脏主要存在于大血管壁和胆管壁，肝窦壁呈连续弱阳性表达。模型组大鼠肝组织肝窦壁表达未见明显变化，但强烈表达于增殖的BECs周围。
LN：假手术组大鼠肝组织内仅见于血管和大胆管周围，肝窦内不明显。模型组大鼠在增生的胆管周围表达显著增加。
FN：假手术组大鼠在肝窦内呈连续表达，在血管周围也有阳性染色。模型组FN除在肝窦内有阳性染色外，强烈地表达于增生的胆管周围。
αSMA：假手术对照组大鼠肝脏仅见于血管平滑肌细胞，肝小叶内未见阳性灶。模型对照组大鼠阳性染色见于汇管区周围的肌成纤维细胞上，且这些肌成纤维细胞围绕在增生的胆管上皮细胞周围。
五、肝组织Hyp含量的变化
假手术组大鼠的肝组织Hyp含量（ug/g湿肝）为130.7±25.5（n=11），模型组大鼠肝组织Hyp含量（538.2±105.6,n=10，P<0.01）显著增高，为假手术组大鼠的4倍（见图2略）。
六、激光显微切割大鼠肝组织内BECs mRNA表达变化
分别采用荧光定量PCR与RTPCR检测BECs表达Procollagen α1(Ⅳ) 、PDGFB、CTGF及TGF-β1 mRNA 的变化。假手术组大鼠BECs有微量TGF-β1 mRNA表达，与假手术组大鼠比较，模型组大鼠BECs表达TGF-β1、CTGF、PDGFB 及Procol α1(Ⅳ)mRNA的量均显著增加（P<0.001），分别为假手术对照大鼠的4.3倍、9倍、12倍与16倍。结果见图1略。
讨论
BECs的增生可分为三种类型。Ⅰ型（典型）BECs增殖：肝内胆管数目增加，但局限在汇管区附近，增殖的BECs构成有内腔的管状结构，从而形成分化较好的三维网络［13］。Ⅱ型(非典型)胆管增生以不规则的肝内胆管增殖为特点，并不局限在汇管区，而是分布在汇管区周围及肝实质内，并形成汇管－实质不规则的界面（“biliary piecemeal necrosis”）。增殖的胆管形成弯曲和不规则的管道，构成三维网状结构，没有形成较好的管腔，并有扩张和中性粒细胞浸润。Ⅲ型胆管增生，也称为“卵圆细胞”增殖，出现在大鼠肝癌形成的早期，其特点是没有形成完整的管腔,其紊乱的管状结构随意地扩展进肝小叶而成扭曲的状态［13］。
与胆汁淤积有关的动物模型中BECs的增生是一种普遍现象，其胆管树对不同的刺激因子产生有选择性的增生反应［4，5］。BDL后胆管的增生区域主要是大胆管细胞，小胆管细胞增生不明显；BDL模型中增殖的胆管细胞来源于原有的BECs并形成连续的腔状结构，经形态学分析证实是由原有胆管纵向扭曲延长所致。
在本研究表明，BECs周围有较多的肌成纤维细胞聚集和细胞外基质的沉积；而炎症及坏死均不明显，偶见汇管区淋巴细胞浸润，胆小管大量增生而占据较大的空间，肝实质细胞的比例显著减少；肝细胞的形态结构尚正常。因此我们认为BDL大鼠胆汁性肝纤维化中以Ⅰ型BECs增生为主，同时也有不同程度的Ⅱ型胆管的增生。
已有研究显示，BECs在刺激纤维化反应方面担当活化的角色，可刺激星状细胞的活化和细胞外基质的生成［6～8］。在胆管发育，胆管癌及CCl4模型的研究中发现，BECs可产生基底膜蛋白和Ⅳ型胶原［9，10］。胆管增生和某些间质细胞活化之间的密切关系也表现在胆管癌中有强烈的促纤维组织增生的反应。
本实验结果显示，BECs的Procollagen α 1(Ⅳ) mRNA表达量显著增加，既表明BECs可直接合成胶原、BECs周围大量沉积的Col Ⅳ可能主要来源于异常增生的BECs；BECs的PDGFB、CTGF及TGF-β1 mRNA表达量也显著增加，且αSMA阳性细胞主要聚集在增生的BECs周围，透射电镜显示BECs周围聚集大量的成纤维细胞和肌成纤维细胞。因此我们认为，BECs周围的ECM一方面由增殖的BECs直接分泌，另一方面BEC分泌PDGFBB、CTGF及TGF-β1，促进HSC的趋化、增殖和活化，转化为肌成纤维细胞，分泌ECM沉积在BEC周围。而Col Ⅰ可能主要是由肌成纤维细胞分泌，沉积增加的部位主要见于肝小叶内。
本研究结果表明，BEC的增生启动HSC活化、增殖、迁移及ECM的沉积，是胆汁性肝纤维化的始动因素和中心病理环节，抑制胆管上皮细胞的异常增生及其细胞生物学病理变化应是抗胆汁性肝纤维化治疗学研究的主要目标。
参考文献
1Desmet V, Roskams T, Van Eyken P. Histopathology of vanishing bile duct diseases. Adv Clin Pathol, 1998; 2∶87-99.
2Desmet V, Roskams T, Van Eyken P. Ductular reaction in the liver. Path Res Pract, 1995, 191∶513-24.
3Desmet V, Roskams T, Van Eyken P. Pathology of the biliary tree in cholestasis:ductular reaction. In: Manns MP, Boyer JL, Jansen PLM, Reichen J, editors. Cholestatic Liver Diseases. London: Kluwer Academic Publishers, 1998∶143-54.
4Tatyana V. Masyuk, Erik L. Ritman, and Nicholas F. LaRusso. Quantitative Assessment of the Rat Intrahepatic Biliary System by ThreeDimensional Reconstruction. American Journal of Pathology, 2001, 158(6)∶2079-2088.
5Alpini G, Ulrich C, Roberts S, Phillips JO, Ueno Y, Podila PV, Colegio O, LeSage GD, Miller LJ, LaRusso NF. Molecular and functional heterogeneity of cholangiocytes from rat liver after bile duct ligation. Am J Physiol, 1997, 272∶G289-G297.
6Caligiuri A, Glaser S, Rodgers RE, et al. Endothelin1 inhibits secretinstimulated ductal secretion by interacting with ETA receptors on large cholangiocytes. Am. J. Physiol, 1998, 275∶G835-46.
7Marra F, De Franco R, Grappone C, et al.Increased expression of monocyte chemotactic protein1 during active hepatic fibrogenesis Correlation with monocyte infiltration. Am. J. Pathol, 1998, 152∶423-30.
8Morland CM, Fear J, McNab G, et al. Promotion of leukocyte transendothelial cell migration by chemokines derived from human biliary epithelial cells in vitro. Proc. AAP, 1997, 109∶372-82.
9Herbst H, Frey A, Heinrichs O, et al. Heterogeneity of liver cells expressing procollagen type I and Ⅳ in vivo. Histochem. Cell Biol, 1997, 107∶399-409.
10Terada T, Nakanuma Y. Expression of tenascin, type Ⅳcollagen and laminin during human intrahepatic bile duct development and intrahepatic cholangiocarcinoma. Histopathology, 1994, 25∶143-50.
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