【摘要】 目的 探讨肺癌抑癌基因1（TSLC1）对人肝癌细胞株HepG2生长的影响。 方法 RT-PCR 法制备TSLC1全长cDNA并克隆至真核表达载体pCI-neo，稳定转染至肝癌细胞系HepG2中。以转染空质粒pCI-neo的HepG2细胞为对照组，野生型HepG2细胞为空白组，显微镜下观察细胞形态，MTT法检测细胞增殖，FACSort流式细胞仪检测细胞周期，AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡情况。 结果 实验建立了高表达TSLC1蛋白的稳定细胞株。实验组细胞呈多角形，聚集成团，细胞之间的黏附非常紧密，对照组和空白组细胞呈梭形，细胞与细胞之间较疏散。与对照组和空白组相比，实验组细胞株细胞生长速度减慢，增殖受到明显抑制，G0/G1期细胞为63.66%±3.83%，高于对照组（47.45%±0.91%）和空白组（54.47%±0.96%）；S期细胞数为22.90%±6.04%，低于对照组（36.58%±0.61%）和空白组（33.61%±2.99%），P＜0.01，实验组细胞周期发生了G0/G1期阻滞。实验组细胞早期凋亡率和晚期凋亡率分别为17.09%±0.20%和16.11%±0.40%，与对照组和空白组细胞相比均明显升高（P＜0.01）。 结论 TSLC1基因明显抑制HepG2细胞生长，并诱导细胞发生凋亡。
【关键词】 癌，肝细胞； HepG2细胞； 抑癌基因
The growth inhibition effects of TSLC1 gene on human hepatocyte carcinoma cell line HepG2 QIN Li, ZHANG Zheng-mao, HAO You-hua, WANG Bao-ju, YANG Xin-xing, TIAN Yong-jun, YANG Dong-liang. Division of Clinical Immunology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
Corresponding author: YANG Dong-liang, Email: dlyang@ tjh.tjmu.edu.cn
【Abstract】 Objective To study the effects of tumor suppressor in lung cancer-1 (TSLC1) on human hepatocyte carcinoma cell line HepG2. Methods A full length of TSLC1 cDNA was amplified from RNA of normal human liver cells by RT-PCR, and it was cloned into a pCI-neo expression vector and transfected into human hepatocellular carcinoma cell line HepG2. The HepG2 cells transfected with this plasmid (experimental group) and those treated with pCI-neo vector (control group) and without any treatment (blank group) were compared. Cell morphology was studied microscopically and cell growth was analyzed with MTT assay. FACSort flow cytometry analysis was performed to assess the cell cycle distribution and apoptosis. Results A stable cell line expressing TSLC1 protein was successfully established. Morphologically, cells of the experimental group were tightly aggregated when compared with those of the control and blank groups. The growth of TSLC1-transfected cells was significantly suppressed in vitro compared with those of the control and blank groups. The amount of G0-G1 cells was 63.66%±3.83% (P < 0.01) in the experimental group, while those of the control and blank groups were 47.45%±0.91% and 54.47%±0.96% respectively. The amount of S phase cells in the experimental group, 22.90%±6.04%, was significantly lower (P < 0.05) than that of the control group (36.58%±0.61%) and the blank group (33.61%±2.99%), which suggested a G0-G1 cell cycle arresting. The number of cells in early and late phase apoptosis (17.09%±0.20% and 16.11%±0.40% respectively) were significantly higher than those of the control and blank groups (P < 0.01). Conclusions TSLC1 strongly inhibits the growth of HepG2 cells in vitro and induces apoptosis of the cells, suggesting that TSLC1 may have a tumor suppressor function in HCC.
【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; HepG2 cells; Tumor suppressor gene
肺癌抑癌基因1（tumor suppressor in lung cancer 1，TSLC1）位于人染色体11q23.2，其编码产物是由442个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员[1]。TSLC1基因是新近发现的与多种肿瘤相关的抑癌基因，在非小细胞型肺癌、肝癌、食道癌、宫颈癌和鼻咽癌等肿瘤中表达水平明显降低。TSLC1介导细胞间相互黏附、胞内信号传导及膜蛋白与细胞骨架之间的交联，在抑制肿瘤细胞生长、侵袭和转移方面发挥着重要作用。本研究将TSCL1基因转入人肝癌细胞HepG2，探讨其对肝癌细胞生长特性的影响。
材料与方法
1．RT-PCR扩增TSLC1基因：按Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司产品）说明书抽提人正常肝组织总RNA，逆转录扩增cDNA。根据GenBank提供的序列（NM 014333）设计合成上游引物：5′-CGGAATTCGACATGGCGAGTGTAGTGCTGC-3′，下划线示引入EcoRⅠ酶切位点；下游引物：5′-CGGTCGACGCCAGTTGGACACCTCATTGAA-3′，下划线示引入SalⅠ酶切位点。以cDNA为模板，PCR扩增TSLC1基因，95℃ 5min预变性，94℃ 50s，55℃ 50s，72℃ 90s，共40个循环，最后72℃终延伸10min。
2．重组质粒的构建：用EcoRⅠ和SalⅠ分别对载体pCI-neo和目的片段进行双酶切，凝胶回收纯化（日本TaKaRa公司产品），产物经T4连接酶（美国Promega公司产品）16℃连接12h，转化感受态细胞DH5α，阳性克隆经PCR和双酶切鉴定正确后送至Invitrogen公司测序。重组质粒命名pCI-TSLC1。
3．细胞转染和克隆筛选：取对数生长期HepG2细胞，接种至24孔板，待细胞融合度达90%时，将pCI-TSLC1质粒及对照质粒pCI-neo分别与脂质体lipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司产品）按0.8μg∶2μl的比例转染。48h后将细胞按1∶10的比例传至6孔板，培养基中加入浓度为400mg/L的G418，隔日换液。待未转染质粒组细胞全部死亡，调整G418浓度为200mg/L，维持培养2周，得到G418抗性克隆，单克隆化4～6周后获得阳性细胞克隆。实验组HepG2细胞转染pCI-TSLC1质粒后，筛选获得1株高表达TSLC1蛋白的细胞克隆。对照组为转染空质粒pCI-neo HepG2细胞，空白组为野生型HepG2细胞。光学显微镜下观察细胞形态。
4．Western blot分析：培养于12孔板稳定表达TSLC1的细胞加Lysis缓冲液60μl，充分悬浮，加入2×SDS Loading缓冲液60μl，充分混匀。100℃沸水浴10min，12000r/min离心30s后以12%的聚丙烯酰胺凝胶分离，然后电转至硝酸纤维膜（Hybond）上。用10% FBS/TBST于4℃封闭过夜后，分别用第一抗体（兔抗人TSLC1，美国Santa Cruz公司产品）和第二抗体（HRP标记羊抗兔IgG，美国Santa Cruz公司产品）孵育1h。最后加发光底物（Lumi-Light Western Blotting Substrate，Roche公司产品）于暗室中充分反应后用胶片曝光10～30min。
5．MTT法检测细胞增殖：细胞以2×103/孔的密度接种至96孔板，连续培养7d。每隔24h行MTT检测。向培养孔中加入10μl MTT（5g/L），37℃孵育4h，加入100μl DMSO，震荡15min，酶标仪上测出540nm吸光度（A）值，参考波长630nm。每组细胞设3个复孔，取平均值绘制细胞生长曲线。
6．细胞周期测定：取6孔板中对数生长期细胞，胰酶消化数分钟后，加PBS吹成单个细胞悬液。PBS洗2次，加入75%乙醇，-20℃固定过夜。细胞离心后PBS洗1次，加入1g/L RNA酶10μl，10mg/L碘化丙啶（PI）溶液10μl，0.5％TritonX-100，室温避光孵育30min，加PBS 400μl，上FACSort流式细胞仪（美国Becton Dickson公司产品）检测分析。实验重复3次，取平均值。
7．AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡：取6孔板中对数生长期细胞，将细胞制备成1×106/ml悬液，取100μl加入5μl FITC-AnnexinV和10μl PI，室温避光孵育15min后，加400μl PBS，用FACSort流式细胞仪分析。实验重复3次，取平均值。
8．统计学分析：数据以x-±s表示，组间比较采用Z检验，P＜0.05时差异有统计学意义。
结 果
1．RT-PCR扩增TSLC1基因、重组质粒酶切鉴定及测序结果：以人正常肝细胞总RNA为模板，RT-PCR扩增得到的目的片段经10g/L琼脂糖凝胶电泳，显示出1条约1.3kb的条带，与预期结果一致。用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切重组质粒后，分别得到大小约4.1kb和1.3kb的条带，与预期结果相符（图1）。重组质粒pCI-TSLC1的测序结果同GenBank上公布的序列比较，核苷酸和氨基酸同源性均为100%。
2．Western blot检测TSLC1蛋白的表达：TSLC1蛋白相对分子质量约70000，实验组高表达，对照组和空白组仅检测到TSLC1的微量表达（图2）。
3．细胞形态的变化：从细胞形态上分析，对照组和空白组细胞呈梭形，细胞与细胞之间较疏散；实验组细胞呈多角形，聚集成团，细胞之间的黏附非常紧密（图3）。
4．TSLC1对HepG2细胞增殖、生长周期和凋亡的影响：MTT方法检测细胞1周内的增殖水平，结果显示，与对照组和空白组相比，实验组细胞株细胞生长速度减慢，增殖受到明显抑制（图4）。实验组G0/G1期细胞高于对照组和空白组（Z＝2.75，P＜0.01），S期细胞数则降低（Z＝2.05，P＜0.05），表明实验组细胞周期发生了G0/G1期阻滞（表1）。与对照组和空白组细胞相比，实验组发生早期凋亡率和晚期凋亡率均明显升高（Z值分别为2.75和4.06，P值均＜0.01），见表2。
讨 论
许多人类肿瘤和癌细胞系中，TSLC1基因的启动子发生甲基化，导致TSLC1表达降低或失活，如非小细胞型肺癌的TSLC1基因启动子发生甲基化的频率为44%，胰腺癌为27%，前列腺癌为32%[1-3]。TSLC1蛋白由胞外段和胞内段组成，胞外段包含3个免疫球蛋白样C2结构域，与细胞黏附分子具有很高的同源性；胞内段由46个氨基酸组成，包含蛋白4.1结合基序和PDZ结合基序，分别与蛋白DAL-1/4.1B及MAGuK结合[4, 5]。Mao等[6]构建TSLC1胞内段两个结合基序缺失突变体，转染A549细胞，细胞增殖，集落形成能力及裸鼠体内成瘤率与野生型A549细胞相比，受到明显抑制，表明TSLC1基因的胞内段在抑制肿瘤生长、侵袭等方面发挥着重要作用。
Kuramochi等[1]进行了TSLC1与肝癌的相关研究，在31例原发性肝癌标本和8株肝癌细胞系中，TSLC1基因启动子发生甲基化率为29%；3株肝癌细胞系TSLC1表达缺失，提示TSLC1与肝癌的发生相关。为了探讨在肝癌中TSLC1是否具有抑癌效应，本研究建立了高表达TSLC1的人肝癌细胞系HepG2，镜下观察细胞生长聚集成团，细胞与细胞之间接合紧密，提示TSLC1可介导肝癌细胞之间的黏附。细胞黏附异常是原发癌发生侵袭和转移的第一步[7]。肺癌、鼻咽癌、食管癌、宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌等许多肿瘤的侵袭和转移都与TSLC1的缺失表达密切相关[8-10]。TSLC1作为细胞黏附分子介导上皮细胞间的相互黏附，并阻止上皮细胞向间质细胞转化[11]。因此，在肝癌进程中，TSLC1的表达降低或缺失可能引起肝细胞之间的黏附异常，导致肿瘤侵袭和转移的发生。TSLC1对HepG2细胞生长也具有明显的抑制作用，细胞培养至第7天时，实验组细胞增殖数仅为对照组和空白组细胞的50%。流式细胞仪分析发现，细胞周期阻滞于G0/G1期，处于静息期细胞增多，分裂期细胞减少。除此之外，高表达TSLC1的实验组细胞，早期凋亡和晚期凋亡的细胞数均显著增加，与A549细胞系中的研究结果一致，提示TSLC1可诱导细胞发生凋亡而发挥抑癌效应。
TSLC1的受体是Ⅰ类限制性T细胞相关分子，在活化的NK细胞和CD8+T细胞表面表达[12]。在肿瘤发生的早期，TSLC1可能经过翻译后修饰或以异常结构暴露于胞膜，而能有效地被活化自然杀伤细胞和T细胞识别。肿瘤进一步发展，胞膜TSLC1表达水平降低，从而逃逸机体的免疫监视。TSLC1是惟一同时参与细胞黏附和机体免疫应答的抑癌基因，其双重作用提示肿瘤的发生、侵袭及转移是一个复杂的过程。本研究证实，TSLC1可增强HepG2细胞之间的黏附作用，抑制细胞增殖，调节细胞周期，并且诱导细胞凋亡，提示TSLC1在肝癌发生发展过程中可能起着非常重要的作用，但TSLC1发挥抑癌效应的具体分子机制还有待进一步的研究阐明。
参 考 文 献
[1]Kuramochi M, Fukuhara H, Nobukuni T, et al. TSLC1 is a tumor-suppressor gene in human non-small-cell lung cancer. Nat Genet, 2001, 27: 427-430.
[2]Murakami Y. Functional cloning of a tumor suppressor gene, TSLC1, in human non-small cell lung cancer. Oncogene, 2002, 21: 6936-6948.
[3]Fukuhara H, Kuramochi M, Fukami T, et al. Promoter methylation of TSLC1 and tumor suppression by its gene product in human prostate cancer. Jpn J Cancer Res, 2002, 93: 605-609.
[4]Yageta M, Kuramochi M, Masuda M, et al. Direct association of TSLC1 and DAL-1, two distinct tumor suppressor proteins in lung cancer. Cancer Res, 2002, 62: 5129-5133.
[5]Fukuhara H, Masuda M, Yageta M, et al. Association of a lung tumor suppressor TSLC1 with MPP3, a human homologue of Drosophila tumor suppressor Dlg. Oncogene, 2003, 22: 6160-6165.
[6]Mao X, Seidlitz E, Ghosh K, et al. The cytoplasmic domain is critical to the tumor suppressor activity of TSLC1 in non-small cell lung cancer. Cancer Res, 2003, 63: 7979-7985.
[7]Hirohashi S, Kanai Y. Cell adhesion system and human cancer morphogenesis. Cancer Sci, 2003, 94: 575-581.
[8]Hui AB, Lo KW, Kwong J, et al. Epigenetic inactivation of TSLC1 gene in nasopharyngeal carcinoma. Mol Carcinog, 2003, 38: 170-178.
[9]Ito T, Shimada Y, Hashimoto Y, et al. Involvement of TSLC1 in progression of esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res, 2003, 63: 6320-6326.
[10]Steenbergen RD, Kramer D, Braakhuis BJ, et al. TSLC1 gene silencing in cervical cancer cell lines and cervical neoplasia. J Natl Cancer Inst, 2004, 96: 294-305.
[11]Masuda M, Yageta M, Fukuhara H, et al. The tumor suppressor protein TSLC1 is involved in cell-cell adhesion. J Biol Chem, 2002, 277: 31014-31019.
[12]Boles KS, Barchet W, Diacovo T, et al. The tumor suppressor TSLC1/NECL-2 triggers NK-cell and CD8+ T-cell responses through the cell-surface receptor CRTAM. Blood, 2005, 106: 779-786. 中华肝脏病杂志版权 |
