【摘要】 目的 用质粒IL-3、CD40L基因在小鼠体内诱导肝脏B220+/DEC205+树突状细胞增殖。 方法 大容量快速小鼠尾静脉注射方法导入质粒IL-3和CD40L基因，Percoll密度梯度离心法分离肝脏非实质细胞，流式细胞仪标记并分离树突状细胞，Giemsa染色和扫描电子显微镜做形态学观察。 结果 实验组小鼠肝脏非实质细胞增殖，主要分布在小叶内、汇管区周围和汇管区。流式细胞仪标记并分离出B220+/DEC205+树突状细胞，实验组B220+/DEC205+细胞（16.0%）较对照组（1.1%）明显增多。Giemsa染色和扫描电子显微镜显示：B220+/DEC205+细胞胞核形状不规则，胞质内无颗粒，胞质具明显突起。 结论 大容量快速尾静脉注射将质粒IL-3和CD40L基因注入小鼠体内，可在肝脏诱导B220+/DEC205+树突状细胞增殖。
【关键词】 肝； 树突状细胞； 基因，白细胞介素-3； 基因，CD40L
Inducing liver-derived dendritic cell proliferation by plasmid-IL-3 and CD40L genes in mice in vivo WANG Ya-lan*, Lina Lu, Shiguang Qian. *Department of Pathology, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016, China
Email: wangyalan074@ gmail.com
【Abstract】 Objective Try to induce liver-derived dendritic cells proliferation by plasmid-IL-3 and CD40L genes in mice in vivo. Methods Rapid tail-vein injection of large amounts of plasmid-carrying genes was performed to transfect genes in mice livers. Liver nonparenchymal cells were isolated by Percoll gradient centrifugation. Dendritic cell markers were detected and dendritic cells were sorted out by flow cytometry. Morphology of dendritic cells was studied microscopically (with Giemsa staining) and under scanning electron microscopy. Results Liver nonparenchymal cells dramatically increased in the liver lobules, portal and periportal areas in the treated group, but not in the control group. B220+/DEC205+ dendritic cells were detected and sorted by flow cytometry. There were more B220+/DEC205+ dendritic cells (16.0%) in the experiment group than those in the control group (1.1%). Morphologically, the sorted B220+/DEC205+ cells showed irregular shaped nuclei, paucity of cytoplasmic granules and extensive cytoplasmic processes. Conclusion B220+/DEC205+ dendritic cells were expanded in vivo in mice livers by rapid tail-vein injection of plasmid-carrying genes encoding IL-3 and CD40L in a large amount. Inducing liver dendritic cell proliferation in vivo provides a more convenient way for studying the biology of these cells.
【Key words】 Liver; Dendritic cells; Gene, interleukin-3; Gene, CD40L
DC是一组形态、结构和功能异质性的专职抗原递呈细胞[1]。不同前体细胞来源或处在不同发育阶段的DC，其细胞表面标志物不同, 在免疫反应中发挥着不同的作用。DC虽分布广泛，但组织内含量极微，因此，有必要对组织中的DC进行诱导扩增，以满足DC基础研究和临床应用的需要。在扩增DC过程中，细胞因子起诱导作用，对于来源相同的单个核细胞，在不同细胞因子作用下，可诱导出不同表型和功能的DC[2，3]。肝脏是一个组织成分复杂的器官，其在人体免疫系统中的作用正日益引起人们的关注和重视。美国Starzl移植所Lu等[4]报道，在IL-3和抗CD40单克隆抗体存在情况下，体外培养小鼠肝脏非实质细胞（nonparenchymal cell, NPC），可诱导出一群新的DC亚群，其表型为DEC205+、B220+、CD19-。认为其与外周免疫耐受的诱导有关。但目前对肝脏DC的深入研究并不多，主要是由于获得大量的肝脏DC较为困难[5]，现用于研究的肝脏DC多是在体外用不同细胞因子刺激DC前体细胞诱导而成。我们用大容量快速尾静脉注射方法，将质粒IL-3和CD40L基因同时注入小鼠体内，在肝脏诱导出B220+/DEC205+ DC，为肝脏DC研究提供了在体研究的动物模型。
材料与方法
1. 材料：实验动物C57BL/6(H-2b)小鼠，雄性，8～10周龄。购自美国Jackson L实验室（Bar Harbor,ME）。清洁级，分笼饲养，给予自由进食和饮水。大鼠抗小鼠藻红蛋白（PE）标记的B220多克隆抗体、FITC标记的羊抗兔IgG购自美国BD PharMingen公司；兔抗小鼠DEC205多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；IL-3 ELISA试剂盒购自美国R&D公司；绿色荧光蛋白（green florescence protein，GFP）、Percoll、Ⅳ型胶原酶及其他试剂均购自美国Sigma公司。质粒IL-3由美国Lu教授（Department of Immunology，Lerner Research Institute，Cleveland Clinic Foundation）惠赠，质粒pORF-mCD40L购自美国InvivoGen公司。
2. 基因转染：参照Zhang等[6]的大容量快速尾静脉注射方法，将质粒IL-3基因20μg溶入2ml PBS中，在7s内从C57BL/6（H-2b）小鼠尾静脉注入。3d后，重复注射1次。以质粒IL-3的空载体质粒为对照，质粒GFP为报告基因。（1）分别于第2次注射后1、2、3、5、7d取血清，用ELISA法检测IL-3水平，操作按试剂盒说明书进行。（2）组织学检测：第二次注射后48h，处死小鼠，分别取肝脏、心脏、肾脏、脾脏、肺脏和脑组织，分别制切片，在荧光显微镜下观察GFP表达情况。每组4只小鼠，实验重复3次以上。
质粒IL-3基因和CD40L基因共转染: 将质粒IL-3基因20μg和CD40L基因20μg溶入2ml PBS中，按上述方法同时注入C57BL/6（H-2b）小鼠，7d后，进行肝脏组织学检测和NPC分离及DC分选。以质粒IL-3和质粒CD40L各自的空载体质粒为对照。每组4只小鼠，实验重复3次以上。
3. 肝脏组织学检测：同时注射质粒IL-3基因和CD40L基因后7d，取肝脏，甲醛固定，石蜡包埋，切片5μm，HE染色。
4. 肝脏NPC分离：按照文献[4]的方法进行。
5. 流式细胞仪检测肝脏中B220+/DEC205+细胞：按照试剂说明书，主要步骤为：取已分离的NPC细胞悬液1ml（1×106/ml），用体积分数10%正常羊血清封闭；PE标记的抗B220 抗体（1∶100稀释）和DEC205抗体（1∶100稀释）同时避光孵育30min；FITC标记的第二抗体室温避光孵育30min；2%多聚甲醛固定；流式细胞仪检测。其结果以阳性细胞百分比表示。设各抗体同型为对照。
6. 流式细胞仪分选B220+/DEC205+细胞：细胞标记方法同5，流式细胞仪分选B220+/DEC205+细胞同5。
7. 对分选的B220+/DEC205+细胞Giemsa染色：取流式细胞仪分选的B220+/DEC205+细胞50μl（2×106/ml）滴片，100%甲醇固定, Giemsa液染色，普通光学显微镜下观察。
8. 扫描电子显微镜观察分选的B220+/DEC205+细胞：对流式细胞仪分选的B220+/DEC205+细胞用4%戊二醛固定后，扫描电子显微镜观察。
结 果
1. 基因转染：大容量快速尾静脉注射质粒IL-3 基因后48h，用ELISA法检测注射后1、2、3、5、7d血清IL-3水平，结果显示，注射后1d血清IL-3水平达最高峰，以后迅速下降，持续5～7d（表1）。取肝脏、心脏、肾脏、脾脏、肺脏和脑组织制切片，在荧光显微镜下观察，报告基因GFP主要在肝脏表达，肺脏、心脏、肾脏、脾脏和脑组织均未见GFP明显表达（图1）。
表1 （略）
2. 肝脏组织学观察：同时注射质粒IL-3基因和CD40L基因后7d，取肝组织HE染色显示，空载体质粒对照组肝脏内NPC无明显增殖，实验组（同时注射质粒IL-3基因和CD40L基因）肝脏内NPC明显增殖，其主要分布在小叶内、汇管区周围和汇管区（图2）。
3. 流式细胞仪检测肝脏中分离的NPC中B220+/DEC205+细胞构成比：对照组肝脏中分离的NPC中，B220+/DEC205+细胞占1.1%，而实验组B220+/DEC205+细胞明显增多，占16.0%（图3）。
4. 对分选的B220+/DEC205+细胞Giemsa染色：对分选的B220+/DEC205+细胞Giemsa染色显示，细胞和胞核形状不规则，核偏位，胞质内无颗粒，出现不同程度的空泡。一些细胞可见到明显的胞质突起（图4）。
5. 扫描电子显微镜观察分选的B220+/DEC205+细胞：细胞表面可见较多的胞质突起（图5）。
讨 论
肝脏因其固有的移植耐受性在免疫耐受研究中受到关注。研究表明，肝移植物容易形成耐受。 在猪、小鼠以及部分大鼠间进行交叉肝移植，即使不使用免疫移植治疗也能克服MHC屏障获得移植接受。 肝移植术后同一个体的其他器官移植也更易形成耐受。1992年，Starzl等发现了细胞嵌合或微嵌合与免疫耐受和移植器官长期存活的现象相关，并认为DC是嵌合细胞的主要成分。Lu等[4]应用IL-3和抗CD40单克隆抗体，在体外从小鼠肝脏NPC中诱导出一群新的DC亚群（其表型为DEC205+、B220+、CD19-）。并对它们的免疫学功能进行了研究，结果显示，这群DC具有诱导调节性T淋巴细胞分化和促进T淋巴细胞凋亡的作用；将其注射到同种异体受体，能使同种异体移植心脏存活期明显延长，提示其可能在诱导移植免疫耐受中发挥重要作用。在此基础上，我们应用大容量快速尾静脉注射方法，将质粒IL-3和CD40L基因同时注入小鼠体内，通过对报告基因GFP的观察，表明该方法注射入小鼠体内的质粒主要在肝脏表达，与文献[6]报道一致。肝脏组织学切片和流式细胞仪分析显示，实验组NPC较空载体质粒对照组明显增殖，实验组NPC中 B220+/DEC205+细胞较对照组显著增多（分别为16.0%和1.1%）。对分选出的B220+/DEC205+细胞进行Giemsa染色和扫描电子显微镜观察，结果均显示该细胞具有DC特征，其形态学特点与我们以前体外培养小鼠肝脏NPC，在IL-3和抗CD40单克隆抗体存在情况下，诱导出的DC亚群（其表型为DEC205+、B220+、CD19-）相似[4]，表明本方法可以在小鼠肝脏中诱导出B220+/DEC205+DC，为肝脏DC研究提供了在体研究的动物模型。
参 考 文 献
[1]Banchereau J, Briere F, Caux C, et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol, 2000, 18: 767-811.
[2]Labeur MS, Roters B, Pers B, et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol, 1999, 162: 168-175.
[3]Duperrier K, Eljaafari A, Dezutter-Dambuyant C, et al. Distinct subsets of dendritic cells resembling dermal DCs can be generated in vitro from monocytes, in the presence of different serum supplements. J Immunol Methods, 2000, 238: 119-131.
[4]Lu L, Bonham CA, Liang X, et al. Liver-derived DEC205+B220+ CD19- dendritic cells regulate T cell responses. J Immunol, 2001, 166: 7042-7052.
[5]Lian ZX, Okada T, He XS, et al. Heterogeneity of dendritic cells in the mouse liver: identification and characterization of four distinct populations. J Immunol, 2003, 170: 2323-2330.
[6]Zhang G, Budker V, Wolff JA. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther, 1999, 10: 1735-1737.
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