【摘要】目的观察甜菜碱对实验性非酒精性脂肪性肝炎（NASH）大鼠的保护作用，并探讨其可能机制。方法32只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量甜菜碱干预组和高剂量甜菜碱干预组。以高脂肪饲料加入诱导脂肪肝药物丙基硫氧嘧啶饲养大鼠构建NASH模型，并对低（200 mg/kg）、高（400 mg/kg［1］）剂量干预组大鼠以甜菜碱溶液灌胃。第12周末处死全部大鼠。应用免疫组织化学技术检测炎症因子γIFN和凋亡相关因子NF-κB在肝组织内的表达，用ELISA技术检测血清胰岛素和炎症因子TNF-α、γ-IFN、IL-10、IL-18，测定Glu、ALT、AST 、TG和T-CHO水平，并进行肝脏病理组织学检查。结果甜菜碱显著降低血清Glu、ALT、TG、T-CHO、胰岛素抵抗（IR）指数、肝脏内γIFN和NF-κB表达（P<0.05）、γ-IFN、胰岛素、TNF-α、IL-18（P<0.01），显著升高IL-10（P<0.01），显著改善脂肪变性和炎症，且低、高剂量干预组间均有显著差异（P<0.05）。结论甜菜碱可防治大鼠NASH，机制可能为改善脂质代谢和胰岛素抵抗、抑制炎症因子和肝细胞凋亡等。
【关键词】甜菜碱； 脂质代谢； 胰岛素抵抗； 炎症因子； 凋亡 The protective effects of betaine on experimental nonalcoholic steatohepatitis in ratsZHANG Wei， GONG ZuoJiong.Department of Infectious Diseases, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,China
【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effects of betaine on experimental NASH in rats and the possible mechanisms of the protective effects.Methods32 male Wistar rats were randomly divided into control ,model,low（200 mg/kg ）and high（400 mg/kg）dose groups. NASH was induced by high fatcontaining diet plus propylthiouracil for 12 weeks.The expression of inflammatory factor γ-IFN and apoptosisrelated factor NF-κB was detected by immunohistochemistry.Serum Insulin，TNF-α,γ-IFN,IL-10 and IL-18 were determined by ELISA.ALT,AST,TG ，T-CHO，and Glu were assayed. Liver histology was also examined.ResultsBetaine treatment resulted in significant decrease serum Glu，ALT,TG,T-CHO，insulin resistance（IR） Index，the expression of γ-IFN ，NF-κB in rats liver tissues (P<0.05)，serum γ-IFN ,insulin，TNF-α and IL-18(P<0.01)，and a significant increase of IL-10（P<0.01）.Betaine also markedly improved liver steatosis and inflammation.There was a significant difference of the above parameters between high and low does treatment groups(P<0.05).ConclusionBetaine has protective effects on rats NASH.The mechanisms possibly attribute to its effects on lipid metabolism and insulin resistance,inhibiting inflammatory factors and apoptosis.
【Key words】Betaine; fatty substance; insulin resistance; inflammatory factor; apoptosis 在NASH的众多复杂的机制中，脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗、细胞因子的作用、细胞凋亡等都是重要的机制［2］。我们研究甜菜碱对脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗、细胞因子和细胞凋亡的影响，以探讨甜菜碱干预NASH的可能机制。
材料和方法
一、材料
盐酸甜菜碱，纯度98%（山东潍坊祥维斯化学品公司），清洁级Wistar大鼠，体重130±10 g，雄性（华中科技大学同济医学院实验动物部），丙基硫氧嘧啶（江苏昆山恒益药品公司）。
二、方法
(一) NASH大鼠模型建立及药物干预参照李文彪［3］等方法诱导大鼠NASH模型。正常喂养一周后，采用随机数字法，将32只清洁级雄性Wistar大鼠（体重130±10 g）随机分为4组，分别为对照组、模型组、低剂量干预组和高剂量干预组，每组8只。除对照组外，其它大鼠每日予高脂肪饲料加入诱导脂肪肝药物丙基硫氧嘧啶（配制：10%猪油+2%胆固醇+0.2%丙基硫氧嘧啶+87.8%普通饲料）饲养大鼠制作实验性NASH模型。每日上午一次，共持续12周。低剂量干预组和高剂量干预组另外再分别以200 mg/kg体重和400 mg/kg体重的盐酸甜菜碱溶液2 mL灌胃干预。正常对照组大鼠则饲以普通饲料，并以等容积0.9%氯化钠溶液灌胃。实验过程中大鼠自由饮水。实验结束时, 禁食一夜，20%乌拉坦（1.0 g/kg）麻醉动物, 处死前称体重，心脏取血，分离血清-20 ℃保存。采血后立即剖腹取肝脏，于10%甲醛溶液固定, 用于肝组织病理形态学检查及免疫组织化学染色检测。血清标本用于检测Glu、ALT、AST、TG、T-CHO、Insulin、TNF-α、γ-IFN、IL-10和IL-18，并计算肝指数（肝湿重/体重×100 %）和胰岛素抵抗指数（血糖×血胰岛素/22.5）［4］。
(二) 肝组织病理形态学观察将肝组织标本剪成大小约为1.0×0.5×0.3 cm3，放入10%甲醛固定12～24小时,然后脱水、透明、浸蜡与包埋、切片，切成约为5 μm厚，HE染色，评价肝组织的脂肪变性、炎症坏死等病理变化。
(三) 血清生化测定转氨酶、葡萄糖、血脂采用SECOMAM BASIC 70VB370型半自动生化分析仪(日本)测定。
(四) 血清Insulin、TNF-α、IL-10、IL-18、γ-IFN测定采用双抗体夹心ABCELISA法。
(五) 免疫组织化学检测肝内γ-IFN和NF-κB表达及定位光镜下每张切片随机选取5个不重叠视野，采用HPIAS100全自动医学彩色图像分析系统，测定平均光密度，计算每组平均值，反应阳性程度。
(六) 肝指数和胰岛素抵抗指数的计算动物处死后，立即取肝脏，滤纸吸干表面水分后称其湿重，计算肝指数和胰岛素抵抗指数。
(七) 统计学处理使用SPSS 12.0统计学软件处理。采用采用单因素多个均数比较的方差分析统计法,进行多组数据之间和各组数据两两之间的均数比较, 多组间比较用Oneway ANOVA检验，组间两两比较用LSD检验，P值小于0.05认为有统计学意义。
结果
实验期间，甜菜碱灌胃第一天，灌胃针误入气管致4只甜菜碱干预组大鼠死亡，其余各组无死亡。
一、各组大鼠体重和肝指数的变化情况
模型组大鼠毛发干枯无光泽，饮食量减少，体重增长缓慢。甜菜碱干预组一般情况明显好于模型组。实验结束时，模型组肝指数显著升高（P＜0.01）；低剂量干预组肝指数无显著下降，高剂量干预组肝指数显著下降（P＜0.05），组间无明显差异。
二、肝组织病理学变化
光镜下对照组肝脏肝小叶结构正常,偶见脂肪滴。模型组肝细胞索排列紊乱，出现程度不等的弥散性肝细胞脂肪变性，小叶内可见炎症，少部分组织可见汇管区炎症，可见少量肝细胞点、片状坏死。低剂量干预组可见少量脂肪空泡，小叶内和（或）汇管区炎症较轻。高剂量干预组肝细胞与对照组接近。见图1（略）。
三、血清转氨酶、血脂、血糖、IR（胰岛素抵抗）指数变化
模型组大鼠血清Glu、ALT 、TG和T-CHO含量均显著升高（P<0.05），AST升高无显著性（P>0.05）。与模型组对比，低、高剂量干预组大鼠Glu、ALT、TG和T-CHO均显著降低（P<0.05），AST降低无显著性（P>0.05），低、高剂量干预组之间有显著差异（P<0.05）。结果见表1（略）。
四、各组大鼠血清TNF-α、IL-10、IL-18、γ-IFN和胰岛素的变化
与对照组比较，模型组大鼠血清TNF-α、γ-IFN、IL-18和胰岛素显著升高（P＜0.01）,IL-10显著降低（P＜0.01）；与模型组对比，低、高剂量干预组大鼠血清TNF-α、IL-18、γ-IFN和胰岛素均显著降低(P＜0.01)，L10显著升高（ P <0.01），低、高剂量干预组之间有显著差异（P<0.05）。结果见表2（略）。
五、γ-IFN和NF-κB在肝组织中的表达与分布
对照组在正常肝细胞内，可见γ-IFN和NF-κB在胞浆内少量表达。NASH模型组肝内γ-IFN和NF-κB表达明显增强，阳性细胞数目明显增多，阳性物质主要集中在胞浆内，阳性细胞着淡棕黄色。低、高剂量干预组肝组织内的表达量减少，其中高剂量干预组肝组织内的表达量更少，接近正常肝组织水平。γ-IFN和NF-κB含量在两干预组差异有显著性（P＜0.05）。两者在不同实验组中相对含量见表3。γ-IFN和NF-κB在肝内表达分别见图2、3（略）；表3（略）
讨论
近年来发现肥胖时肥大的脂肪细胞分泌的一些细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)能加重NAFLD［6］。肥胖患者脂肪细胞分泌TNF-α增多［7］。与模型组相比，低、高剂量甜菜碱干预组大鼠经甜菜碱治疗，大鼠肝脏内γ-IFN和NF-κB表达明显降低，ELISA检测显示TNF-α、γIFN和IL-18显著降低，IL-10显著升高，且在低、高剂量甜菜碱干预组之间有显著差异。表明甜菜碱抗非酒精性脂肪性肝炎的可能机制与甜菜碱抑制炎症因子释放、抑制肝细胞凋亡有关［8］，且与药物剂量有一定关系，从而为临床应用甜菜碱治疗非酒精性脂肪性肝炎提供了依据。
甜菜碱在干预非酒精性脂肪肝炎的过程中，作为甲基供体［9］。甜菜碱为脂肪代谢提供甲基,主要作用是: (1) 参与磷脂合成, 促进肝脂肪转移; 抑制脂肪肝的形成; (2) 参与磷脂酰胆碱的合成,影响血液脂蛋白浓度; (3) 甜菜碱还可能作为机体内一些与脂肪代谢有关物质提供甲基，直接参与甲基化反应，促进肝脂迁移，影响血液脂蛋白浓度及为肉毒碱合成提供甲基。此外，甜菜碱能促使肝脏和肌肉中肉碱的合成量增多，使脂肪酸的运载增强，促进脂肪和肌细胞线粒体内脂肪酸的β氧化，并由此反馈性地增强了不同阶段脂肪分解酶的活力，加强了脂肪的分解，使体内脂肪沉积相对减少。
本研究表明，甜菜碱可防治非酒精性脂肪性肝炎，其机制可能为改善脂质代谢和胰岛素抵抗、抑制炎症因子释放、抑制肝细胞凋亡等。
参考文献
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