【摘要】目的寻找高效抑制细胞色素P450 3E1（CYP2E1）基因转录的位点，构建该位点的siRNA表达载体。方法用PCR的扩增物作为表达框架，直接转染E47细胞，产生siRNA抑制CYP 2E1基因转录，筛选高效抑制CYP 2E1基因表达的位点，并构建BS/U6/CYP2E1的表达质粒，转染E47细胞，观察该质粒在E47细胞中发生RNAi效果。结果4个备选位点的抑制效率最高，用该位点构建BS/U6/CY2E1的表达质粒可有效地、特异地抑制CYP2E1基因的表达。结论用PCR产物作为表达框架，在体内产生双链的siRNA作为筛选高效的RNA干扰位点的方法，既快速又简便。用该位点的构建BS/U6/CYP2E1的表达质粒可用于CYP2E1基因的功能研究、酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪性肝病的发病机制及肿瘤发生的研究等领域中。
【关键词】细胞色素 P450 2E1； 小干扰RNA； RNA干扰 Construction of siRNA expressive vector to the optimal point depressing transcription for cytochrome P450 2E1 geneXu Yun, Wan Zhihong, Li Jichang.The Department of Gastroenterology in The First Affiliated Hospital of Zhenzhou University, Zhenzhou 450052, China[WT〗
【Abstract】ObjectiveTo screen out the optimal point depressing transcription for P450 2E1 (CYP 2E1) gene, and construct siRNA expressive vector to the point .MethodsThe siRNA expresion cassettes was constructed by PCR,and the PCR products was directly transfected into E47 cells resulting in functional expression of siRNA to depress expression for CYP2E1 gene,to screen out the optimal point to depress transcription for CYP 2E1 gene,and constructed a BS/U6/CYP2E1 which was a DNA vectorbased approach to achieve RNAi in E47 cells.ResultsThe point 1233～1251 was the potimal ones in the four preliminary points, and BS/U6/CYP2E1 could show genespecific suppression of CYP 2E1.Conclusiona facile PCR based strategy for rapid synthesis of siRNA expression units were tested. The siRNA expression unit are constructed by PCR, and the PCR products are directly transfected into mammalian cells resulting in funtional expression of siRNAs. This approach may prove useful for identification of optimal siRNAtarget combinations. Constructed BS/U6/CYP2E1 could be used in studying the function of the CYP2E1,the pathogenesis of alcoholic and nonalcoholic fatty liver disease and carcinogenesis.
【Key words】cytochrome (CYP2E1)450 2E1; siRNA; RNAi
细胞色素P450 2E1（CYP2E1）在人肝脏中含量丰富，并且富集于肝小叶中心区域［1］，是乙醇和许多药物代谢的重要系统［2］。促进了肿瘤的发生。本试验用RNA干扰抑制肝细胞CYP450 2E1的基因转录。
材料与方法
一、材料
（一） 质粒、细胞和寡核苷酸E47细胞（转染了CYP2E1基因的重组载体，能稳定高表达CYP2E1基因的细胞），E34（转染了用于构建CYP2E1基因重组载体的原始载体，无表达CYP2E1基因的功能，作为E47细胞的对照）和pSilen Circle/P53(可在体内产生siRNA，发生针对P53基因RNA干扰的重组载体，美国绿阳生物技术和制药有限公司，pmU6（-315/+1）载体由解放军第三军医大学西南医院感染科万志红博士赠送。
（二）主要试剂Line SilenceTMRNA干扰转录试剂盒购于美国绿阳生物技术和制药有限公司。
二、方法
（一） 选择siRNA的靶位点
从转录本（mRAN）AUG起始密码子向下游数50～100nt开始扫描靶基因中的AA［3］。记录每个AA3′端19个核酸作为可能的siRNA靶位点；筛选G/C含量30%～50%左右的序列（特别在3′端）；有丰富的A/U；潜在的序列的第10位为T（非必须考虑），无内部互补结构；将潜在序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠、大鼠等）比较，进行同源性分析，排除那些和其他编码序列同源的序列。将选中的四条序列（588～606，975～993，1233～1251，1263～1281）用表达框架法PCR扩增，产物用于RNA干扰，实验筛选最佳位点。
（二）用LineSilenceTMRNA干扰转录试剂盒筛选最佳的siRNA的靶位点
设计基因特异性下游PCR引物，产生反义的siRNA转录，其引物的合成遵循以下方法设计：5′caaaaaactgtaaaaa GN17C ggtgtttcgtcc tttccacaaga3′；产生正义的siRNA转录，其引物的合成遵循以下方法设计：5′caaaaactg taaaaarcGN17C ggtgtttcgtcctttccacaaga3′。4个待选的寡核苷酸序列的设计见表1（略）。
（三）用表达载体在体内以DNA模板产生siRNA的设计策略设计的寡核苷酸的5′端和3′端分别含EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点，便于和表达载体pmU6连接，5′端开始位19个核苷酸的siRNA作用链序列，中间以9个核苷酸TTCAAGCAA间隔形成发卡结构，下面连接siRNA作用链反向重复序列，和3′端加有转录终止信号TTTTT。
（四）人的CYP2E1基因的RNA干扰的siRNA的表达载体的构建
1.序列设计:按照上述原则化学合成两条寡核苷酸链，正义链5′AATTCgccagaacacttcctgaat TTCAAGCAA attcaggaagtgttctggc TTTTT A3′。反义链5′AGCTTAAAAAgccagaacacttcctgaatTTGCTTGAAattcaggaagtgttctggcg3′。另设计一条对照序列，将该段序列的核酸序列打乱随即排序，为正义链5′AATTCacagcgaaccttgaccattTTCAAGCAA aatggtcaaggttcgctgtTTTTT A3′，反义链5′AGCTTAAAAAacagcgaaccttgaccattTTGCTTGAAaatggtcaaggttcgctgtG3′。
2.siRNA表达载体的构建和鉴定:pmU6(-315/+1)载体用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,用1%的琼脂糖凝胶电泳,回收3.3 bp左右的条带,Promega gel 回收纯化系统提取回收切开的质粒.分别取1 μl(含3 μg)两条序列的寡核苷酸,加入48 μl退火液中混匀,94 °C 4 min,70 °C 10 min退火，立即冰化液涂于LB琼脂平板，依据蓝白斑筛选出含能够表达siRNA的CYP2E1目的基因的阳性克隆，并对28个克隆的菌落用M13引物（M1：5′GTAAAAGGACGGCCAGT3′，M2：5′GGAAACAGCTATGACCATG3′）做PCR扩增，产物琼脂糖凝胶电泳鉴定，挑选出株进行DNA序列分析加以确定，2号菌落的克隆取名为BS/U6/CYP2E1。采用同样的方法进行对照序列的构建和鉴定，取名为BS/U6/CYP2E1C。
（五）转染
用PCR得到的产物为siRNA的表达框架，和BS/U6/CYP2E1（BS/U6/CYP2E1C）均用脂质体转染试剂Lipfectamine2000转染E47和E34细胞细胞，具体方法见美国Invitrogen公司产品说明书。
（六）CYP2E1基因的检测和内对照的设定
检测CYP2E1基因的PCR产物为289 bp，（542～830），上游引物5′CGTCATAGCCGACATCCT3′，下游引物5′CTCCATTTCCACGAGCAG3′。退火温度为54 °C。内对照用βactin，上游引物5′AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGA3′产物为587 bp，退火温度为5°C。对CYP2E1基因转录进行RNA干扰的siRNA的特异性参照基因；P53上游引物5′gctcagatagcgatggtc3′，下游引物5′gcacaggcacaaacacg3′产物为289 bp，退火温度为54°C。用RTPCR 检测E47和E34内CYP2E1基因的转录水平。
结果
一、通过PCR取得可以体内产生siRNA的表达框架
用试剂盒提供的通用上游引物的模板，用4个位点的8条正义链和反义链的下游引物，按说明书操作，产生PCR产物，将每个位点的正义链和反义链的PCR产物合并，用Promega公司的PCR产物纯化系统纯化，取1 μl凝胶电泳，结果见图1。
二、4个位点表达框架产生siRNA抑制CYP2E1基因转录的效果比较
4个位点的的正义链和反义链的PCR产物纯化后分别转染细胞，24 h后，抽提总RNA，用βactin和CYP2E1的引物做RTPCR，产物凝胶电泳，得到的RNAi的结果见图2（略）。
三、BS/U6/CYP2E1的阳性克隆的鉴定
从28个克隆的菌落中选出1、2、3、4、5和20号6个菌落，用M13引物做PCR扩增，3、5、20号菌落扩出的片段为550 bp，菌落2和4号菌落扩出的片段为600 bp，说明2和4号菌落的克降含插入成功的手段，凝胶电泳结果见图3（略）。BS/U6/CYP2E1重组载体序列正确。
四、观察BS/U6/CYP2E1（BS/U6/CYP2E1C）在E47细胞中的RNA干扰作用
BS/U6/CYP2E1、BS/U6/CYP2E1C和pSlien/P53分别或共同转染E47细胞，培养24 h后，取细胞提取总RNA，反转录得到cDNA，分别用βactin、CYP2E1和引物做PCR扩增，凝胶电泳结果见图4（略）。
讨论
CYP2E1因以乙醇可诱导形式，参与了许多重要的毒性底物（如乙醇、四氯化碳、醋氨酚等）的活化和代谢而引起广泛关注［4］。乙醇是被CYP2E1代谢的首要物质，以往称为微粒体乙醇氧化系统（MEOS）［5］。乙醇、丙酮、游离脂肪酸、亚硝胺类及烟草中的化学物质等许多经CYP2E1代谢的底物均能诱导其表达，使其mRNA的水平增高或蛋白的稳定性增加［6］。对CYP450 2E1基因的研究在酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝病、药物代谢、药物性肝损伤和肿瘤发生中都有重要的价值。
RNA干扰（RNAi）是指双链的RNA诱导的转录后降解同源性RNA，这一现象在植物、真菌、昆虫、原生动物和哺乳动物的细胞内都可观察到，双链的RNA被加工成21到23个核苷酸长度的双链片段，称为小干扰RNA（siRNA）［8，9］，这个siRNA形成一个称为RNA诱导的［7～9］沉默复合物（RISC）［11］，它引起同源的RNA降解。在哺乳动物细胞内序列特异性RNA干扰现象可通过直接转染siRNAs和内生性表达21到23个核苷酸长度的RNA或长发卡RNA观察到。但是在一个基因的全部mRNA序列的各个位点中并不是siRNA介导的转录下调同样敏感［12］。本研究显示，在BS/U6/CYP2E1C和pSilecCircle/p53的对照下，BS/U6/CYP2E1能有效地、特异地抑制CYP2E1基因的转录。
参考文献
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