【摘要】目的研究己酮可可碱对肝纤维化模型大鼠β-连环蛋白(β-catenin)表达的影响。方法用CCl4诱导制备大鼠肝纤维化模型，试验组全程给予己酮可可碱治疗。测定大鼠血清ALT、Ⅳ型胶原含量及肝组织中β-catenin的表达和分布。结果正常大鼠肝脏不表达β-catenin；肝纤维化大鼠肝组织中β-catenin的表达呈强阳性,多表达于胞质，且向细胞核内转移；经己酮可可碱治疗后，试验组大鼠肝纤维化程度地显著降低，胶原面积占肝组织的面积百分比下降(P<0.05）,β-catenin的表达显著减少(P<0.05），两者呈正相关(r=0.842,P<0.001）。结论βcatenin在纤维化程度高的肝组织的表达增强，是肝脏纤维化程度的反应指标；己酮可可碱能显著降低纤维化大鼠肝脏β-catenin的表达，延缓大鼠肝纤维化的发展。
【关键词】β-catenin； 己酮可可碱； 肝纤维化； Ⅳ型胶原 The Effect of pentoxifylline on the expression of β-catenin in rats with hepatic fibrosisLi Wenting, He Yongwen.Union hospital, tongji medical college of huazhong university of science and technology. wuhan, hubei 430022， China
Corresponder: He Yongwen. Email:hyw581441@yahoo.com.cn
【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of pentoxifylline on the expression of β-catenin in hepatic fibrosis rats. MethodsCCl4 was used to produce rats hepatic fibrosis. The treatment group were treated with pentoxifylline. At the end, serum level of ALT and type Ⅳ collagen in all groups of rats were measured and the expression and distribution of βcatenin and type Ⅳ collagen the liver were examine. Resultsβ-catenin did exist in normal rats' livers. There were much βcatenin and type Ⅳ collagen in the liver of the model group than that in the treatment group (P<0.05). In the model group, β-catenin existed in cytoplasm and then shifted into cell nucleus. There was a significant positive correlation between the amount of β-catenin and type Ⅳ collagen in the fihosis liver of rats (r=0.842,P<0.001).ConclusionThere is much β-catenin and type Ⅳ collagen in the fibrosis liver of rats. The increase of β-catenin corresponded to a the severerity hepatic fibrosis. Pentoxifylline can significantly reduce the expression of β-catenin in the liver of rats so that it can also delay the process of hepatic fibrosis.
【Key words】β-catenin； pentoxifylline； hepatic fibrosis； type Ⅳ collagen
在多种肿瘤（尤其是消化道肿瘤如肝癌，结肠癌等）、免疫性疾病、纤维化过程中均有异常的高表达［1,2］。如何逆转和阻断肝纤维化发生是慢性肝病防治的关键［3］。本文采用己酮可可碱干预，着重观察β-catenin在纤维化肝组织中的表达及其和纤维化程度的相关性。
材料与方法
一、动物分组及模型制备
雄性Wistar 大鼠75只，由华中科技大学同济医学院动物中心提供，体重200-300 g。分为三组，每组25只：对照组为正常大鼠（N组），肝纤维化模型组（M组），己酮可可碱干预试验组(J组)。N组大鼠给予一般饲料喂养；M组和J组共50只Wistar大鼠，全部给予40% CCl4橄榄油制剂皮下注射（四氯化碳为分析纯试剂，由武汉亚法提供），0.3 mL/100 g,2次/周,共10周. J组全程给予己酮可可碱灌胃干预（己酮可可碱，Pentoxifylline，德国益通药业，400 mg/片）,剂量为180 mg/(Kg·d)［1］ 每周随体重增减剂量 。造模第10周，随机选取M组4只大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉后断头处死，活检证实纤维化形成，造模成功。随即将所有大鼠麻醉后处死，下腔静脉取血，分离血清，-20 ℃保存，并取肝脏组织10%甲醛固定。
二、检测方法及指标
(一) 血清ALT、Ⅳ型胶原ALT使用自动生化分析仪测定，Ⅳ型胶原采用ELISA方法（试剂盒购于武汉晶美生物工程公司）。
(二) 肝组织病理学检测常规石蜡切片，苏木素伊红（HE）染色，取多个方位观察肝组织纤维化分级（依据第5次全国传染病寄生虫病学术会议制定的诊断标准）。
(三) 肝组织Ⅳ型胶原和β-catenin 的免疫组化检测 每一个标本取两张切片分别进行两种抗体（Ⅳ型胶原和β-catenin）免疫组织化学染色，并计算纤维组织占肝组织总面积的百分比（Ⅳ型胶原和β-catenin抗体均由武汉晶美生物工程公司提供）。对每张切片随机选择5个低倍视野，用Image－Pro Plus软件进行图像分析后取平均值，并比较不同纤维化级别之间β-catenin染色的差异。
三、统计学处理
本文所有数据均用SPSS11.5软件处理，华中科技大学同济医学院已购买版权。
结果
一、一般情况
N组大鼠毛白柔软,精神食欲好,发育正常；M组大鼠毛微黄、粗糙、直立，精神差，发育迟滞，随着时间的增长，食欲渐差；J组大鼠介于两者之间。N组大鼠无死亡；M组大鼠在造模第1、3、4、6、7周分别死亡2只、1只、1只、2只、1只，共死亡7只；J组大鼠在造模第1、3、6周均死亡1只，共死亡3只。造模结束后三组分别剩余老鼠25只、18只、22只。
二、血清中ALT、Ⅳ型胶原的水平
M组大鼠血清中ALT、Ⅳ型胶原水平明显高于J组（P均<0.05），J组明显高于N组（P均<0.05）。见表1（略）。
三、肝脏组织Ⅳ型胶原和β-catenin的表达
HE染色显示N组大鼠肝细胞结构完整，沿细胞索呈放射状分部，排列规则，无假小叶形成胶原纤维面积百分比为(0.22±0.1)%；M组大鼠肝细胞广泛坏死，可见增生的肝细胞团，小叶结构紊乱，胶原染色可见胶原纤维增生明显，包围分割肝小叶，可见假小叶形成，肝纤维化面积达86.5%胶原纤维面积百分比为(11.6±1.1)%；J组可见肝细胞坏死程度减轻，胶原含量明显减少，胶原纤维面积百分比为(5.0±0.9)%。J组肝组织Ⅳ型胶原的表达低于M组（P<0.05）,高于N组（P<0.05）；这说明己酮可可碱能够明显改善纤维化肝脏的组织学变化。
N组大鼠肝脏细胞不表达β-catenin，组织切片可见细胞核以及胞浆均未着色（染色阴性，－）；M组大鼠肝脏细胞可见细胞核以及胞浆均黄染（染色强阳性。＋＋）；J组大鼠组织切片可见肝脏细胞胞浆黄染，胞核未着色（染色阳性，＋）。图像分析显示：25例N组β-catenin染色的强度和范围平均值为10101.5，22例J组为34256.7，18例M组为50043.6。表明J组肝组织β-catenin的表达低于M组（P<0.05）,高于N组（P<0.05）。因此可以认为，己酮可可碱在降低肝脏β-catenin表达的同时也抑制肝纤维化的发展，β-catenin在肝组织的表达量可以反映大鼠肝组织的纤维化程度(见图1，2略)。
四、β-catenin的表达水平和肝脏纤维化程度的相关分析
图像分析显示：23例0级纤维化肝组织β-catenin染色的强度和范围平均值为10080.6，11例1级为23529.1，13例2级为39641.8，12例3级为46675.9，6例4级为56806.4；说明纤维化程度越高的肝组织其β-catenin的表达越强(P均<0.05)。相关分析表明：β-catenin在肝组织中的表达强度和其纤维化程度呈显著正相关关系，r=0.842,P<0.001。见表2（略）。
讨论
Wnt基因是最近发现的一个基因群。Wnt至少参与调节三条互相独立的信号通路：β-catenin通路、细胞极性通路（planar cell polarity pathway）、Ca2+信号通路。目前人们对β-catenin通路研究得最透彻，证实它确实参与了多种组织纤维化的发生和发展［4,5］。
β-catenin是一种胞质内蛋白，正常情况下含量极少，很快被胞质内的一种多蛋白复合体磷酸化（这种复合体包括轴索蛋白Axin、酪蛋白激酶1α、糖原合酶激酶3β），随即被蛋白酶降解，因此，胞质内β-catenin含量较少。Wnt基因活化后，和细胞表面的卷曲样受体蛋白和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)相结合，抑制多蛋白复合体对β-catenin的磷酸化，从而发挥对β-catenin的保护作用。β-catenin就会在胞质内聚集，进而向核内转移，结合核内转录因子TCF/LEF（T细胞因子/ 淋巴样增强因子），启动一系列基因的转录，增加多种细胞因子的分泌，促进细胞分化、增殖、转化等［6］。有研究表明：wnt基因的活化及β-catenin的表达增强在整个胚肝发育过程中都发挥着重要的作用；抗β-catenin在体外能够严重阻碍肝细胞的发育［7］；β-catenin能够促进谷氨酰胺合成酶1、肝药酶P450、CYP1A2、CYP2E1的合成和活化［8］；活化星状细胞β-catenin的表达量是静止状态的6倍［9］。因此，我们认为β-catenin在肝脏的发育、代谢和维护肝脏正常功能方面以及在在肝纤维化的发生和发展过程中发挥了重要的作用。
己酮可可碱（pentoxifylline, PTX），目前主要用于治疗急慢性缺血性脑血管病、周围血管血流障碍性疾病、脉管炎等［10］。目前已经发现其在治疗肝纤维化方面有良好的疗效，可能的机制为：(1) 抑制一系列能活化星状细胞，促进纤维化形成的细胞因子的产生；(2) 抑制去甲肾上腺素的缩血管作用，降低血液粘滞度，改善肝脏微循环，缓解纤维化的发展；(3) 抑制磷酸二酯酶活性，抑制胞内cAMP的降解，能改善肝脏微循环。
本研究表明，β-catenin参与了肝脏纤维化的发生、发展，其在肝组织中的表达和肝纤维化程度呈正相关，在一定程度上反应了肝脏纤维化的严重程度。Wnt/β-catenin的上述特征可能成为新的抗纤维化的研究靶点。己酮可可碱能有效地抗肝纤维化，在降低肝脏β-catenin表达的同时也降低了胶原含量。而目前我们对己酮可可碱治疗肝纤维化的机制及其和Wnt/β-catenin信号传导通路互相作用的机制均知之甚少，这些都值得我们深入研究。
参考文献
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上海《肝脏》杂志社版权
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