【摘要】目的探讨己酮可可碱pentoxifylline PTX对大鼠非酒精性脂肪性肝炎TNF-α表达的影响。方法雄性SD大鼠40只，随机分成正常对照组、模型组、治疗组3组,实验需16周。正常对照组（10只）饲以普通饲料，模型组（20只）及治疗组（10只）饲以高脂饲料。12周时从模型组中随机抽取10只处死，病理证实为脂肪性肝炎；余下的模型组及治疗组大鼠继续高脂饲料饲养，同时治疗组大鼠予以PTX16 mg/kg·d灌胃4周。至16周时处死所有剩余大鼠，分别检测各组动物的体重、肝指数、血生化指标；进行HE染色观察肝脏病理学改变；并应用免疫组织化学方法分析和观察TNF-α表达。结果与模型组比较PTX治疗组大鼠体重、肝指数［（608.50±52.92） g对（668.00±62.86） g,(4.11±0.47)对（4.85±0.61），P<0.05和P<0.01］显著降低;肝脏生化得到改善［AST（120.20±34.59） U/L对（221.80±100.36） U/L，P<0.01］；空腹血糖降低［（9.04±0.997） mmol/L对（10.58±1.871） mmol/L，P<0.05］，且肝组织炎症活动度计分明显下降［（5.70±0.94）对（6.72±0.84），P<0.01］。组织化学显示TNF-α在肝脏中的表达显著降低［（0.172±0.042）对（0.43±0.038），P<0.01］。结论己酮可可碱可改善高脂饮食诱发的脂肪性肝炎大鼠肝脏酶学，减轻肝组织炎症损伤，具有治疗作用；其治疗机制之一可能是抑制TNF-α在肝脏中的表达。
【关键词】非酒精性脂肪性肝炎； 己酮可可碱； 肿瘤坏死因子； 大鼠 ZHANG Li*, JIA Jidong, ZHANG Hua, WANG Dan, AN Wei.*Beijing Shijingshan Hospital, Beijing 100043, China
Corresponding author: ZHANG Hua, Department of Histology and Embryology, Capital Medical University, Email: huazh4541@vip.sina.com.
【Abstract】ObjectiveTo study the therapeutic effects of pentoxifylline (PTX) on rat nonalcoholic steatohepatitis.MethodsForty male SD rats weighting 130～150 g were randomly divided into three groups: control group (n=10), model group (n=20) and treatment group (n=10). The control group were given normal diet, the model group and treatment group were given fatrich diet. Ten rats of model group were sacrificed after 12 weeks of experiment. Then, the treatment group were given PTX (16 mg/kg·d) at 12 week of fatrich diet feeding. At the end of 16 weeks, all rats were sacrificed and the serum samples and liver were investigated with the biochemistry, histopathology and immunohistochemistry for TNFα.Results1.At the end of experiment,compared with the model group, the body weight（608.50±52.92 g vs 668.00±62.86 g，P<0.05）, liver index (4.11±0.47 vs 4.85±0.61, P<0.01), the serum concentration of AST（120.20±34.59 U/L vs 221.80±100.36 U/L,P<0.01）and FBG (9.04±0.997 mmol/L vs 10.58±1.871 mmol/L， P<0.05)in the treatment group were significantly lower,.2. The hepatic inflammation scores decreased markedly in the treatment group （5.70±0.94 vs 6.72±0.84，P<0.01）. 4. Compared with model group, the expression of TNF α in treatment group was significantly decreased (0.172±0.042 vs 0.43±0.038，P<0.01).ConclusionThe therapeutic effects of pentoxifylline on rat nonalcoholic steatohepatitis is possibly mediated by lowering TNF-α.
【Key words】Nonalcoholic steatohepatitis； Pentoxifylline； Tumor necrosis factor alpha； Rats
非酒精性脂肪性肝病(NASH)患者的血清中TNF-α水平明显升高［1］，NASH肝组织及脂肪组织中TNF-α mRNA有过度表达，且在炎症坏死浸润和进展性肝纤维化越明显的患者中，这种过度表达的程度就越高［2］。 己酮可可碱(PTX)为TNF-α的拮抗剂，国外研究证实其对胆碱缺乏所致的脂肪性肝炎治疗有效［3］。本实验应用高脂饮食建立脂肪性肝炎模型，旨在观察PTX对NASH的治疗效果，初步探讨其治疗机制。
材料与方法
一、实验材料
(一) 实验动物雄性SD大鼠40只，清洁级，体重140g±10 g，购自首都医科大学实验动物中心。
(二) 实验仪器OLYMPUS AU640全自动生物化学分析仪，Leica AutoStainer XL染色仪、Leica ASP300自动脱水机、Leica EG1160自动包埋机。Leica Qwin图像分析系统。
(三) 实验试剂己酮可可碱由德国通易药业有限公司提供,100 mg/5 mL/支,进口注册证号(中国)X20000248。
二、方法
(一) 模型建立与分组雄性SD大鼠40只，正常喂养一周后,抽签法随机分成3组, 正常对照组10只、模型组20只、PTX治疗组10只。正常对照组饲以普通饲料，模型组及治疗组饲以高脂饲料（88%普通饲料、10%猪油、2%胆固醇），于12周时从模型组中随机抽取10只处死，病理证实为脂肪性肝炎。余下的模型组及治疗组大鼠继续高脂饲料饲养，同时治疗组10只大鼠予以PTX16 mg/kg·d灌胃4周。实验动物自由饮水和进食，分笼饲养于（20±2） ℃明暗各12 h的动物室内。16周处死所有剩余大鼠。方法均为隔夜禁食, 2%戊巴比妥钠0.023 mL/kg腹腔注射麻醉,腹主动脉采血8 mL后再迅速取出肝脏，按常规制备血清和肝组织切片。
(二) 观察指标及测定方法实验期间每周称体重1次, 同时观察大鼠食欲、行为、状态、毛发情况。实验结束处死动物时称体重及肝脏湿重,并计算肝脂数(肝湿重/体重×100%)。用自动生化仪检测血清ALT、AST、TG 、TC、FBG。
(三) 组织病理学检查HE染色及炎症活动计分：取出的肝脏用Bouin液固定, 常规石蜡包埋，切片,切片厚度为5 μm，HE染色；评估肝脏组织炎症活动情况。
(四) 免疫组织化学染色免疫组织化学SP法染色，PBS替代第一抗体作阴性对照。
(五) 切片观察及结果判定NASH炎症活动计分标准：参照Promrat K等［4］研究中的标准，并进行改良。包括脂肪变性及肝小叶炎症两项：脂肪变性0～4分，其中<5%肝细胞脂肪变性计0分、5%～25%肝细胞脂肪变性计1分、25%～50%肝细胞脂肪变性计2分、50%～75%肝细胞脂肪变性计3分、>75%肝细胞脂肪变性计4分。肝小叶炎症0～4分，其中无炎性病灶计0分、<1个炎性病灶/2个20HP计1分、1个炎性病灶/2个20HP-1个20HP计2分、2个炎性病灶/1个20HP计3分、>2个炎性病灶/1个20HP计4分。标本以物镜20倍观察5个视野，每次所得计分相加并取均值即为此标本的炎症活动度计分。
TNF-α表达变化TNF-α的阳性表达为细胞桨内呈现棕黄色颗粒。采用计算机图像系统分析摄片，光镜下每张切片各取5个视野（物镜×40），分别计数各视野组织阳性细胞率（阳性细胞数/视野内细胞总数×100%），结果以均值表示。
(六) 统计学处理采用SPSS11.5统计软件进行数据的统计分析，结果以均数±标准差表示,先进行数据的正态性检验、方差齐性检验，符合上述条件的行单因素方差分析，组间比较应StudentNewmanKeuls检验；P<0.05为差异有显著性意义。
结果
一、一般情况
实验过程中无动物死亡。高脂饲料饲养的各组大鼠体毛逐渐发黄、稀疏，性情较温顺，不喜动。各组大鼠体重均呈进行性增长。实验结束 时模型组体重、肝湿重和肝指数明显增高，与正常对照组比较有非常显著性差异（P＝0.007，P＝0.000及P＝0.000）；而PTX治疗组体重、肝湿重和肝指数明显降低，与模型组比较有显著性差异（P＝0.043、P＝0.003及P=0.004）见表1略)。
二、血清生化指标的变化
血清ALT、AST变化：模型组ALT、AST水平明显升高,与正常对照组比较有非常显著性差异（P=0.003、P=0.000），治疗组AST水平显著下降,与模型组比较有非常显著性差异（P＝0.002）。而两组ALT比较无差异（P＝0.055）。血脂、血糖的变化：模型组与正常对照组比较TC、FBG明显增高，差异有显著性意义（P=0.012及P=0.049）；TG有升高趋势，但无统计学意义(P=0.251)。治疗组FBG较模型组显著下降（P=0.018）。治疗组TG和TC虽有下降趋势，但无统计学意义(P=0.679及P=0.114)。详见表2（略）。
三、组织学结果
(一) 正常对照组肝脏组织学改变（见照片1）HE染色显示肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，偶见少量炎性细胞浸润。
(二) 12周模型组肝脏组织学改变HE染色显示肝小叶结构紊乱，肝细胞弥漫性脂肪变性，呈以大泡性为主的混合性脂肪变性，达到中重度脂肪肝程度，以肝小叶周边为明显,所有大鼠均可见小叶内炎性细胞浸润，炎症细胞以单核细胞为主，以点状、灶状分布，偶见肝细胞气球样变性。
(三) 16周模型对照组肝脏组织学改变（见照片2）HE染色显示与12周NASH组相比，肝细胞大泡性脂肪变性比例增多，肝小叶结构紊乱，肝索结构消失，肝细胞间隙扩大，气球样变性肝细胞数量增多，炎性细胞浸润明显，可见部分炎性坏死灶融合成片，并出现碎屑样坏死。与正常对照组比较肝脏炎症活动度计分显著增高（P=0.000）。
(四) PTX治疗组肝脏组织学改变（见照片3）HE染色显示炎性细胞浸润明显减轻，未见炎症坏死灶融合成片及碎屑样坏死，余基本同模型对照组。但与模型对照组比较肝脏炎症活动度计分明显下降（P=0.003）。见表3（略）。
本实验模型参照范建高［5］等人的文献报道，与其不同之处为病理学表现的脂肪变性及炎性细胞的浸润以肝腺泡Ⅰ、Ⅱ区为明显，可能与此区血液供应相对丰富，血液中的高脂成分及代谢产物首先引起此区肝细胞的损伤有关。此方法操作简便，动物死亡率为0。应用此方法建立的肥胖、高血脂、高血糖及转氨酶增高的NASH模型，能够较好的反映人类由于生活方式及饮食结构不合理所致的脂肪性肝炎发生、发展过程，因此是研究NASH发病机制和筛选防治方案的良好实验材料。不足之处为未能证实胰岛素抵抗现象。
实验结果显示模型组转氨酶活性明显升高，并出现肥胖、高血脂、高血糖；组织学炎症计分明显增高；同时肝脏TNF-α组织细胞阳性表达率明显增高，即从免疫组织化学方面证实了TNF-α在NAFLD发病机制中的重要作用，与文献报道［1，2］结果一致。予以PTX治疗后可见肝脏转氨酶的活性显著降低；组织学显示炎症活动度明显下降，其作用机制可能与抑制肝脏组织细胞TNF-α的表达有关，本实验中治疗组肝脏TNF-α组织阳性细胞的表达率明显降低。另外实验显示PTX治疗组大鼠体重、肝湿重及肝指数均明显下降，其中以肝湿重减低更为明显，提示肝脏体积缩小，脂肪变性减轻，可能与PTX改善肝脏微循环使得肝脏的各种代谢功能得以恢复，肝脏内的脂质含量减少有关。
PTX是非选择性磷酸二酯酶的抑制剂，通过抑制磷酸二酯酶活性，减少环磷酸腺苷（cAMP）降解，提高细胞内cAMP的浓度，降低TNF-αmRNA的转录，从而减少TNF-α产生。最近的临床［6］和实验研究［3］显示PTX一方面通过增加谷胱甘肽过氧化物酶的作用提高谷胱甘肽的含量，促使氧化和抗氧化机制恢复平衡，阻断了自由基的链式反应；另一方面降低了TNF-α的表达，由于TNF-α产生的减少可能减弱了炎症级联反应，使肝细胞的结构、功能恢复正常。Sanjay K［7］等的研究亦显示PTX可能成为一种较有希望的药物，不仅因其具有较高的安全性，而且其具有多重作用，即可降低血清肝脏转氨酶水平，同时可改善胰岛素抵抗及患者的一般状况。因此，抑制促炎因子的表达与释放应是防治NASH的一种有效手段。
本研究治疗组大鼠肝脏转氨酶、血脂、血糖均明显下降，与正常对照组比较有显著性差异,说明PTX 可明显改善NASH大鼠的生化指标，提示PTX治疗NASH有效。从组织学方面分析，肝组织炎症活动度亦明显减轻，但并未完全恢复正常。一方面考虑与高脂饮食的诱因未祛除有关，另一方面可能与PTX使用的疗程有关。说明NAFLD的发病机制复杂，控制饮食及减轻体重是最基础的治疗，药物治疗是辅助措施。
参考文献
1Wigg AJ, RobertsThmson IC, Dymock RB, et al. The role of small intestinal bacterial overgrowth, intestinal permeability ,endotoxeamia, and tumor necrosis factor alpha in the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis. Gut, 2001，48∶206-11.
2Crespo J, Cayon A, FernandezGil P, et al. Gene expression of tumor necrosis factor alpha and TNFreceptor, p55 and p75, in nonalcoholic steatohepatitis patients. Hepatology, 2001， 34∶1158-63.
3Koppe SWP, Sahai A, Malladi P, et al. Pentoxifylline attenuates steatohepatitis induced by the methionine choline deficient diet. J Hepatol, 2004,41∶592-598.
4Promrat K, Lutchman G, Uwaifo GI,et al.A pilot study of pioglitazone treatment for nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology, 2004，39(1)∶188-96.
5范建高，钟岚，王国良，等.枯否氏细胞在非酒精性脂肪性肝炎发病机制中的作用. 中华肝脏病杂志,2001,9∶16-18.
6Adams LA, Zein CO, Angulo P, et al. A pilot trial of pentoxifylline in nonalcoholic steatohepatitis Am J Gastroenterol, 2004,99∶2365-2368.
7Sanjay K. Satapathy, Sanjay Garg, Ranjeet Chauhan, et al. Beneficial effects of tumor necrosis factor alpha inhibition by Pentoxifylline on clinical, biochemical, and metabolic parameters of patients with nonalcoholic steatohepatitis. Am J Gastroenterol, 2004，99∶1946-1952.
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