【摘要】目的了解cccDNA与病毒复制及拉米夫定耐药突变（YMDD）及肝脏病变的关系。方法采用分子信标PCR技术检测HBV携带者、慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、肝癌患者血清中cccDNA与HBVDNA及YMDD突变。结果对283例不同HBV感染者血清进行了cccDNA检测，阳性123例（43.46%），全部为HBVDNA阳性标本；cccDNA与血清HBVDNA相关（χ2=28.27，P<0.01）及ALT相关（χ2=48.46，P<0.01)。68例接受拉米夫定治疗半年以上患者复查血清ALT、HBVDNA、YMDD及ccDNA，显示ALT异常32例（与cccDNA相关χ2=48.46，P<0.01），HBVDNA 阳性24例（与cccDNA相关χ2=28.27，P<0.01），其中包括YMDD阳性18例与cccDNA阳性16例（P=0.046）。结论血清cccDNA，是反映HBV复制及肝脏细胞损伤的血清标志。监测YMDD与血清cccDNA可以提示抗病毒治疗中HBV复制状态及病变进展情况。
【关键词】肝炎病毒； 乙型； cccDNA； 聚合酶链反应； Clinical Relationships between cccDNA in Sera and HBVDNA, YMDD Mutants and Hepatitis B RelapseWU Fenting, LU Qijun.Dongying City People's hospital, Shandong, 257091
【Abstract】Objectiveto investigate Clinical Relationship between cccDNA, HBVDNA, YMDD Mutants in Sera and Hepatitis B Relapse. MethodsPCRmolecularbeacon technique,which is capable of differentiating of HBV viral genomic DNA and cccDNA, was used to test p gene YMDD motif mutation, HBV DNA and cccDNA in sera of subjects with HBV asymptomatic carriers (ASC), chronic hepatitis (CHB), liver cirrhosis (LC) and hepatocellular carcinoma (HCC). Results123 cccDNA positive samples were detected in 283 subjects' sera(48.3%), The positive cccDNA percentage in patients with ASC, CHB, LC, and HCC were 17.8%,78.4%,37.5%,and 20% respectively,(χ2=10.88, P<0.01). cccDNA was close related with active hepatic inflammation (χ2=318.75,P<0.01). cccDNA could only be detected from HBVDNA positive sera samples and was correlated with levels of alanine aminotrasferase (χ2=48.46,P<0.01). 68 cases were examined for ALT,HBVDNA and YMDD mutations including YIDD and YVDD after treated with Lamivudine for half a year， 32 cases were ALT abnormal，HBVDNA was positive in 24 cases,including YMDD mutations in 18 and cccDNA in 16 cases(correlation with cccDNA were χ2=48.46,P<0.01, χ2=28.27,P<0.01 and P=0.046 respectively). ConclusionThe existence of cccDNA in sera, indicates HBV replication and liver damage.YMDD and cccDNA may reflect HBV replication status, and the hepatic inflammation extent upon antiviral treatment.
【Key words】hepatitis B virus; covalently closed circular DNA; polymerase chain reaction
肝组织中cccDNA是一个可反复转录的完整模板，是嗜肝病毒持续感染的关键因素［1，2，3］；血清cccDNA的意义尚不十分清楚。为此我们检测分析了血清cccDNA与血清HBVDNA及贺普丁治疗后血清HBVDNA及HBV-YMDD基因变异的关系。
材料与方法
一、材料
(一) 血清标本283例HBV感染者中，86例HBV携带者的血清采自东营人民医院与油田中心医院门诊，其余197例HBV感染相关性肝病患者为两院住院病人。其中男性186例，女性97例，年龄在20—68岁，平均年龄（中位数）38.8岁。诊断符合2000年第十次全国传染病与寄生虫病学会和肝病学会联合修订的病毒性肝炎防治方案。
(二) 主要仪器及试剂PE9700基因扩增仪，AS260荧光检测仪。DNA提取试剂盒（SepGene RVR）(日本)、PCR试剂盒与两种（YVDD、YIDD）YMDD变异探针和HBVcccDNA荧光分子信标探针，均为第一军医大学基因诊断中心提供。
在探针的5′端标记FAM，在3′端标记DABCYL。引物均由上海生物工程公司合成，探针均由一军大基因诊断研究中心采用固相亚磷酸三脂合成法标记。分子信标探针的颈环部连接CATCGG（5′端）与GCGATG（3′端）。
二、方法
(一) HBV-YMDD PCR扩增先取DNA聚合酶1.2ul加入反应液管内，然后取处理后标本上清液、阴性对照和阳性对照上清液各5ul分别加入反应液管内， 混匀后10000rpm离心10 s，上机循环。（同时设空白对照一管）。扩增程序94°C预变性3 min，循环条件：94°C30S ，60°C75S，共40个循环；最后置28°C保温。
(二) HBVcccDNAPCR扩增先取DNA聚合酶1.2ul加入反应液管内，然后取处理后标本上清液、阴性对照和阳性对照上清液各5ul分别加入反应液管内， 混匀后10000rpm离心10 s，上机循环。（同时设空白对照一管）。第一次PCR：取处理后的样本上清液、阴性对照上清液及阳性对照上清液各5 μL各自分别加入反应液管Ⅰ内，混匀后10000rpm离心10 s上机扩增。扩增程序 94 ℃预变性3 min，循环条件：94 ℃30 S、55 ℃40 S、72 ℃45 S，共38个循环，最后72℃延伸3 min。
(三) PCR反应后荧光检测待各PCR管充分冷却至28°C后迅速将反应管放入荧光检测仪，读取并记录荧光值，荧光激发波长为487 nm，检测波长为518 nm。
三、统计学处理：
采用χ2检验及Fisher精确概率统计比较，以α<0.05为显著性标准。
结果
一、血清cccDNA总检出率
283例HBVDNA阳性血清cccDNA阳性123例（43.46%），在ASC组、CHB组与LC组和HCC组分布分别为17.8%,78.4%,37.5%,20%，与肝炎活动相关（χ2=318.75,P<0.01）。见表1（略）。
二、接受拉米夫定治疗但出现HBVDNA反跳者cccDNA检出率
68例接受拉米夫定治疗半年以上的慢性肝病患者中，出现HBVDNA反跳24例（包括HBV-YMDD阳性18例）全部进行HBVcccDNA检测。另外选取36例血清HBVDNA阴性者一同检测血清cccDNA。结果显示：24例血清标本中检测到HBVcccDNA阳性16例，全部肝功能异常；其中3例在肝功能化验正常时血清HBVDNA与cccDNA呈阳性，持续一段时间后均出现肝功能异常并存。HBVDNA阴性者cccDNA全部阴性。见表2（略）。
讨论
cccDNA不与蛋白共价结合，是最先能检测到的复制中间体,是嗜肝DNA病毒mRNA和前基因组RNA的合成模板,在本质上反映了病毒的复制，而其它中间体（如环状RNA、逆转录的DNA等）都只是一次性产物，只能间接反映病毒复制。cccDNA是一个可反复转录的完整模板，是嗜肝病毒持续感染的关键因素［1，2，3］。肝组织cccDNA是评价HBV 感染状态及抗病毒疗效的重要指标。
在核苷类似物治疗过程中，HBV的P基因变异导致耐药的产生是病毒自身发生突变的结果,这种耐药毒株逐渐累积成为优势毒株,导致耐药性的产生［4，5］。研究显示38.7%的患者ALT反跳时伴有HBVDNA反跳，而只有18.5%的HBVDNA反跳时合并有ALT的反跳，HBVDNA的反跳与ALT的反跳似乎没有必然的联系［5］。本组接受拉米夫定68例半年到两年后分别出现了32例ALT的反跳，进行耐药突变（HBV-YMDD）检测有18例。肝功能血清指标波动可能尚有其他原因，值得临床注意。
我们初步检测表明cccDNA阳性在ASC组、CHB组与LC组和HCC组分布分别为17.8%,78.4%,37.5%,20%。cccDNA可以先于血清肝功能生化指标的变化，血清cccDNA阳性肝功能多为异常，提示血清cccDNA与肝功能损害相关［2，3，6］；进一步动态观察表明，在半年至两年的拉米夫定治疗后检测到24例HBVDNA反跳，其中YMDD变异阳性18例，血清cccDNA 阳性16例，提示抗病毒治疗过程中，由于病毒耐药突变的发生可以出现血清HBVDNA水平反跳，伴有组织细胞的变性坏死和cccDNA的释放［6］。可能平常检测的HBVDNA是总DNA（total DNA,tDNA），包括基因组DNA与cccDNA［6］，因此血清cccDNA与血清HBVDNA相关，并出现血清HBVDNA阴性者血清cccDNA必定阴性，cccDNA阳性血清标本必定HBVDNA阳性的结果［6］。通常血清HBVDNA水平升高被看作HBV 复制的重要参数，故血清cccDNA可能也是HBV复制的相关指标［6］。
血清cccDNA可能是HBV复制导致肝细胞损害的早期血清学标志［3，6］。这有待进一步的研究加以证实。
参考文献
1姚桢.乙型肝炎病毒分子生物学.分子乙型肝炎病毒相关病学.北京，中国医药科技出版社，1998年 第一版；1-9.
2He ML, Wu J, Chen Y, Lin MC, Lau GK, Kung HF.A new and sensitive method for the quantification of HBV cccDNA by realtime PCR. Biochem Biophys Res Commun. 2002 Aug 2;295(5)∶1102-1107.
3Chen Y, Sze J, He ML .HBV cccDNA in patients' sera as an indicator for HBV reactivation and an early signal of liver damage. World J Gastroenterol. 2004 Jan;10(1)∶82-85.
4Zhou T,Guo JT,Nunes FA,et al.Combinition therapy with lamivudine and adenovirus causes transient suppression of chronic woodchuck hepatitis virus.infections. J Virol, 2000,74∶11754-11763.
5Lampertico P,Malter JS, Gerber MA.Development and apllication of an in vitro model for screening antihepatitis B virus therapeutics.Hepatology, 1991,13∶422-426
6吕其军，李玉生，李毅，等.肝病患者血清cccDNA与HBV复制及肝组织损伤的关系.基础医学与临床.2005，11（25）∶1069-1070.
［编后语：本文选题很有意义，以下两个问题值得进一步讨论：(1)如何证明所检测的就是cccDNA,而并非假阳性；(2)所检测的YMDD变异结果是否代表优势株?是否同时检测到野生株? 编者］
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