反义真核细胞转化生长因子βⅠ型受体与反义基质金属蛋白酶组织抑制因子1联合作用对大鼠肝纤维化的影响

【摘要】  目的  观察反义转化生长因子βⅠ型受体（TβRⅠ）真核表达质粒与反义基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）真核表达质粒联合作用对实验性大鼠肝纤维化的影响。 方法  构建大鼠反义真核细胞表达质粒，导入大鼠肝纤维化模型体内，通过Ⅰ型胶原的免疫组织化学以及苦味酸－酸性品红染色观察两种反义质粒联合作用对大鼠肝纤维化的影响，用目标积分吸光度（A）值表示各实验组动物肝组织中蛋白的表达量。 结果  反义TβRⅠ治疗组、反义TβRⅠ+反义TIMP-1治疗组、反义TIMP-1治疗组、pcDNA3.1(+)空质粒对照组、模型对照组、正常对照组TβRⅠ蛋白的A值分别为：（2.11±0.88）×105、（1.06±0.57）×105、（3.46±1.14）×105、（5.66±2.54）×105、（5.19±1.22）×105和（0.38±0.27）×105；TIMP-1蛋白的A值分别为：（1.10±0.22）×105、（0.30±0.12）×105、（0.65±0.15）×105、（2.05±0.36）×105、（1.97±0.28）×105和（0.10±0.12）×105；Ⅰ型胶原的蛋白表达的A值分别为：（4.37±1.30）×105、（0.90±0.32）×105、（3.40±0.91）×105、（6.90±1.61）×105、（7.34±1.68）×105和（0.41±0.21）×105。反义TIMP-1治疗组TIMP-1蛋白表达量显著降低（P＜0.05），反义TβRI治疗组TβRI蛋白表达量显著降低（P＜0.05），两种反义质粒可有效抑制相应蛋白的表达；反义TIMP-1表达质粒与反义TβRⅠ表达质粒均可减少受损肝脏中Ⅰ型胶原的沉积（P<0.05），联合应用可进一步减少受损肝脏中Ⅰ型胶原的沉积（P<0.01）。在病理形态学方面的观察，反义TIMP-1表达质粒与反义TβRⅠ表达质粒均可使受损肝脏的病理形态有一定改善，联合应用可使受损肝脏的病理形态得到进一步的改善。结论  反义TIMP-1表达质粒与反义TβRⅠ表达质粒对肝纤维化的发展均有一定的干预作用，联合作用可产生更有效的阻止作用。
【关键词】  肝硬化； DNA，反义；受体，表皮生长因子； 金属蛋白酶组织抑制因子-1　
Combined effects of antisense TβRI eukaryotic expressing plasmid and antisense TIMP-1 eukaryotic expressing plasmid on rat liver fibrosis    ZHENG Yong, XU Li-hong, LI Rui, ZHOU Ting, SUN Kan, CHANG Xiang-yun, CHEN Wei-gang, CHENG Ying. Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital of Shihezi University, Shihezi 832008, China
Corresponding author: XU Li-hong, Email: shzds-sh@ xj.cninfo.net
【Abstract】    Objective    To test the hypothesis that the introduction of antisense transforming growth factor beta receptor I (TβRI) plasmid and antisense tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP-1) eukaryotic expressing plasmid into a rat liver fibrosis model may influence the progression of liver fibrosis. Methods    Fragments of TβRI cDNA and TIMP-1 cDNA were obtained by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and then amplified by nest PCR. pcDNA3.1(+)-antisense TβRI eukaryotic expressing plasmid was constructed by directional and inverted joins with the purified linear pcDNA3.1(+) and the purified fragment of TβRI, as well as, pcDNA3.1(+)-antisense TIMP-1 eukaryotic expressing plasmid. The recombinant was identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequence analysis. The recombinant plasmids were encapsulated with Lipofectmine 2000, and then they were injected intraperitoneally into the liver fibrosis model rats. The protein expression of type I collagen was evaluated by immunohistochemistry. VG staining of liver slides of the rats was used for histopathological examination. Results    Compared with the empty plasmid control group and the disease control group, the deposition of type I collagen decreased in the three antisense treatment groups: antisense TβRI group (4.37±1.30)×105, P < 0.05; antisense TIMP-1 group (3.40±0.91)×105, P < 0.05; antisense TβRI + antisense TIMP-1 group (0.90±0.32)×105, P < 0.01; treatment control group (6.90±1.61)×105; disease control group (7.34±1.68)×105; and the normal control group (0.41±0.21)×105]. Significant differences in the pathological grades of fibrosis were found between the normal control group and the other five groups (P < 0.05) and also between the disease control group and the three antisense treatment groups (antisense TβRI group P < 0.05; antisense TIMP-1 group P < 0.05; antisense TβRI + antisense TIMP-1 group P < 0.01), but no difference was found between the empty plasmid control group and disease control group (P > 0.05). Conclusion    Both antisense TβRI eukaryotic expressing plasmid and antisense TIMP-1 eukaryotic expressing plasmid can inhibit the progress of liver fibrosis. A combined action can inhibit the progress of liver fibrosis more.
【Key words】  Liver cirrhosis; DNA, antisense; Receptor, epidermal growth factor; Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase
 肝纤维化是一个复杂的多因素作用过程，其中涉及到细胞因子、ECM及细胞之间的相互作用和相互影响。目前，关于肝纤维化的治疗，单用一种细胞因子，或用一种细胞因子抗体或其受体拮抗剂来阻止疾病发展的实验性研究很多[1-7]，而对细胞因子网络整体调整的研究报道较少。我们运用重组DNA 技术构建鼠反义真核细胞转化生长因子βⅠ型受体（transforming growth factor β receptor Ⅰ，TβRⅠ）表达质粒和反义TIMP-1真核细胞表达质粒，并利用脂质包埋处理后，导入CCl4复合法制备的大鼠肝纤维化模型体内，观察同时调整两种细胞因子的表达对实验性大鼠肝纤维化的影响。
材料与方法
1．反义质粒的构建和鉴定：取-80℃冰冻保存的大鼠肝组织，应用Trizol法提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度。根据TβRⅠ和TIMP-1全基因cDNA序列设计PCR扩增内、外引物两对，均由上海Sangon公司合成。引物序列：TβRⅠ外引物：5′-ACAGGCGCAAACAGTGGCAG-3′和5′-AGTCTCGTAGCACAATGGTCC-3′；内引物：5′-TTCACCTCGAGAGTGGCAGCGG GACC-3′（XholⅠ）和5′-CTACCGAATTCT GGACCATCAGCATAAG-3′（EcoRⅠ）；TIMP-1外引物：5′-GGATGAGCAGATACCACGA-3′和5′-GACATAGTTCTTTATTTCAC-3′；内引物：5′-TTCACCTCGAGACCACGTGGCGCCCTTT G-3′（XholⅠ）和5′-TCCGCAGAATTCGTAAA CAGTGTTCAGGCTTCA-3′（EcoRⅠ）；下划线示酶切位点。使用一步法RT-PCR试剂盒（德国Qiagen公司产品）获得目的基因TβRⅠ cDNA、TIMP-1 cDNA片段；巢式PCR扩增TβRⅠ、TIMP-1基因片段；纯化回收PCR产物，使用限制性核酸内切酶EcoRⅠ、XholⅠ（美国Promega公司产品）双酶切pcDNA3.1(+)，纯化回收线性化pcDNA3.1(+)后和TβRⅠ、TIMP-1基因片段定向及反向连接，构建以pcDNA3.1(+)为载体的反义TβRⅠ真核表达质粒、反义TIMP-1真核表达质粒。用CaCl2法诱导感受态细胞。热休克法转化JM109大肠杆菌。酶切证实的阳性克隆送上海生物工程公司测序分析。
2. 大鼠肝纤维化模型制备及质粒导入：雌性SD大鼠90只，体重170～210g，新疆医科大学实验动物部提供，清洁饲养。实验大鼠随机分为6组：反义TβRⅠ治疗组、反义TIMP-1治疗组、反义TβRⅠ+反义TIMP-1治疗组、pcDNA3.1(+)空质粒对照组、模型对照组和正常对照组，每组15只。除正常对照组外，其余各组整个试验过程采用CCl4复合法制备大鼠肝纤维化模型，在实验进行2周后，各组随机处死1只大鼠，确定受攻击组大鼠病理学诊断进入肝纤维化早期后，实验第3周开始，各治疗组按组别将反义基因导入大鼠肝纤维化模型，反义TβRⅠ重组质粒、反义TIMP-1重组质粒、pcDNA3.1(+)空质粒每次各100、50、50μg，反义重组质粒按比例与Lipofectmine 2000混匀静置30min后，经腹腔导入体内，每9d 1次至第8周，共注射5次。同时正常对照组腹腔注射0.9%的等渗盐水。
3. 结果观察：实验动物第8周结束后，各组随机处死1只大鼠，确定模型对照组病理学诊断有假小叶形成。乙醚吸入麻醉，由腹正中线切皮进腹，取部分肝组织置于4%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，超薄切片机切片，厚度为4μm，病理及免疫组织化学检查。部分肝组织-70℃保存备用。 应用苦味酸-酸性品红染色（VG）观察肝组织病理形态学变化，进行肝纤维化的病理形态学分级，分级标准参照《病毒性肝炎防治方案》[8]；应用免疫组织化学法观察肝组织中TβRⅠ、TIMP-1和Ⅰ型胶原的表达，Ⅰ型胶原多克隆抗体、TβRⅠ多克隆抗体、TIMP-1多克隆抗体均为武汉博士德生物制品公司产品，工作浓度分别为1∶100、1∶150和1∶100。Ⅰ型胶原采用SABC三步法，TβRⅠ、TIMP-1采用Envision两步法。三者第二抗体均为丹麦DAKO公司的Envision第二代生物素标记的工作液（鼠，k5007）。Ⅰ型胶原的第三抗体为武汉博士德生物制品公司生产的SABC试剂盒自带。DAB显色。结果采用奥林巴斯-BX51图像分析系统测定阳性染色平均吸光度（A）及占视野面积，用目标积分A值表示各实验组动物肝组织中蛋白的表达量，目标积分A值=目标平均A值×目标面积。
4．统计学处理：实验结果计量资料采用SPSS 11.5软件描述实验数据特征，行成组设计多样本比较秩和检验Kruskal-Wallis法；多样本间两两比较秩和检验Nemenyi法，等级资料病理形态学分级结果行Ridit分析，P<0.05为差异有统计学意义。
结    果
1．一般情况：实验过程中有两只大鼠非正常死亡，一只系正常对照组，被它鼠攻击死亡，一只系pcDNA3.1(+)空质粒对照组，考虑腹泻死亡。
2．实验大鼠的肝组织形态学观察：肉眼观，可见正常对照组肝组织表面光滑、质软，色泽为暗红色，边缘锐，体积形态正常；肝纤维化模型对照组及空质粒组的肝体积缩小，重量减轻，质地变硬，表面有较多且大小不等的结节；各反义质粒治疗组均可见肝体积有不同程度的增大，肝被膜紧张，质地稍硬，边缘变钝，色泽变淡，形态基本正常（图1略）。
3. 各实验组动物肝组织中TβRⅠ蛋白和TIMP-1蛋白的表达：各实验组动物肝组织中TβRⅠ蛋白和TIMP-1蛋白的表达量差异有统计学意义（χ2值分别为65.53和69.80，P值均＜0.01），见表1（略）。与空质粒组和模型对照组相比，反义TβRⅠ治疗组TβRⅠ蛋白表达量显著降低（P＜0.05），反义TIMP-1治疗组TIMP-1蛋白表达量显著降低（P＜0.05）；反义TβRⅠ＋反义TIMP治疗组TβRⅠ蛋白表达量显著降低（P＜0.01），TIMP-1蛋白表达量显著降低（P＜0.01）。空质粒对照组和肝纤维化模型组相比，TβRⅠ蛋白和TIMP-1蛋白表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。
4．各实验组动物肝组织中Ⅰ型胶原检测结果：在正常肝脏组织，阳性染色仅见于中央静脉和汇管区血管壁，纤维排列纤细。在肝纤维化组和空质粒对照组，阳性部位以肝内纤维间隔组织为主，中央静脉和汇管区血管壁亦可见阳性反应，Ⅰ型胶原表达明显增多，纤维排列粗宽，并积聚成条索和间隔，从汇管区向肝小叶内延伸，形成假小叶。治疗组阳性染色以胶原纤维，中央静脉和汇管区血管壁为主，纤维排列较为纤细（图2略）。各实验组动物肝组织中Ⅰ型胶原的表达量差异有统计学意义（χ2＝66.19，P＜0.01），见表1。反义TβRⅠ治疗组较空质粒组和模型对照组Ⅰ型胶原表达量显著降低（P＜0.05）；反义TIMP-1治疗组较空质粒对照组和模型对照组Ⅰ型胶原表达量显著降低（P＜0.05）；反义TβRⅠ＋反义TIMP治疗组Ⅰ型胶原表达量较空质粒组、模型对照组显著降低（P＜0.01）。三个治疗组之间相比，反义TβRⅠ＋反义TIMP治疗组较反义TβRⅠ治疗组、反义TIMP-1治疗组Ⅰ型胶原表达量显著降低（P＜0.01），反义TβRⅠ治疗组与反义TIMP-1治疗组之间差异无统计学意义（P>0.05）。
5．各实验组动物肝组织肝纤维化病理学分级结果：正常对照组与各实验组之间的病理学分级差异有统计学意义（P＜0.01），各反义治疗组与空质粒组、模型对照组之间的病理学分级差异有统计学意义(P＜0.01)，反义TβRⅠ+反义TIMP治疗组较反义TβRⅠ治疗组、反义TIMP治疗组，病理学分级明显改善（P＜0.05），模型对照组与空质粒组之间的病理学分级差异无统计学意义（P>0.05），见表2。
表2　(略)

讨    论