【摘要】 目的 探讨HepG2细胞中HCV非结构蛋白5A（NS5A）对HCV IRES启动蛋白翻译的影响，以了解HCV的复制调控机制。 方法 将构建的表达双荧光素酶的双顺反子载体pCMV-Rluc-IRES-Fluc和含HCV NS5A基因的表达质粒pcDNA-NS5A共转染HepG2细胞，用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平，细胞免疫荧光技术检测HCV NS5A蛋白的表达，RT-PCR检测虫荧光素酶基因mRNA水平，并与相应对照做比较，以观察HCV NS5A对HCV IRES介导虫荧光素酶翻译水平的影响。 结果 转染pcDNA-NS5A的HepG2细胞中虫荧光素酶活性明显高于转染pCDNA3.1-3flag的对照组，并存在剂量依赖关系；而RT-PCR虫荧光素酶基因mRNA水平在两组间差异无统计学意义。转染pcDNA-NS5A的HepG2细胞质中可见HCV NS5A蛋白的表达。 结论 HCV NS5A 蛋白对HCV IRES介导虫荧光素酶的翻译有正调节作用，并存在剂量依赖关系。
【关键词】 肝炎病毒，丙型； 病毒非结构蛋白质类； HCV IRES
The effect of HCV NS5A protein on HCV IRES-dependent translation in HepG2 cells CHEN Juan, CHEN Wei-xian, ZHANG Zhen-zhen, HUANG Ai-long. Key laboratory of Infectious Diseases, Institute for Viral Hepatitis, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400010, China
Corresponding author: HUANG Ai-long, Email: ahuang@ public.cta.cq.cn
【Abstract】 Objective To study the effect of HCV NS5A protein on HCV IRES-dependent translation in HepG2 cells. Methods HepG2 cells were co-transfected with a plasmid vector containing a bicistronic transcript carrying Renilla luciferase and firefly luciferase genes separated by HCV IRES sequences, and an expressing vector producing the NS5A protein. The luciferase activity and the mRNA of the luciferase gene were then detected. The NS5A expression was confirmed by fluorescence microscopy. Results HCV NS5A protein was detected in the cytoplasm of the HepG2 cells transfected with pcDNA-NS5A, and the luciferase activity was up-regulated in the presence of the HCV NS5A protein while the expression of luciferase mRNA showed no difference. Conclusion HCV NS5A protein can upregulate the HCV IRES activity and this effect is dose-dependent with NS5A.
【Key words】 Hepatitis C virus; Viral nonstructural proteins; HCV IRES
丙型肝炎是严重威胁人类健康的重要传染病，除引起急、慢性肝炎外，还易导致肝纤维化甚至肝癌。HCV是一长约9.6kb的线状单股正链RNA病毒，包括一个大的读码框架和两端的非翻译区（untranslating region,UTR），即5′UTR-C-E1-E2/NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-3′UTR。HCV 5′UTR具有复杂的二级结构，其中的内核糖体进入基序（IRES）以非帽依赖性方式启动病毒基因翻译。目前对于HCV IRES启动病毒翻译的具体调节机制仍知之甚少，并且关于病毒蛋白对IRES功能的影响仍存在争议。在HCV病毒蛋白中，NS5A是一个多功能的蛋白，包含447个氨基酸，与NS3、NS4B形成复制复合物调节NS5B的RNA聚合酶活性，从而调节病毒的复制水平[1]。它所具有的抗凋亡功能[2]、与PKR的结合活性、转录激活作用、干扰细胞内信号转导通路、诱导钙释放以及诱导IL-8的产生等多项生物学活性，提示其在病毒持续感染和肝细胞癌发生中可能具有重要作用。本实验通过HepG2细胞瞬时表达系统研究HCV NS5A蛋白对HCV IRES启动蛋白翻译的调节作用。
材料与方法
1． 材料：质粒pGL3 enhancer，RL-TK，pEGFP-C1，pcDNA3.1-3flag购自美国Invitrogen公司，含HCV1a基因型全长cDNA质粒H/FL由美国Rocofelller大学的Rice教授惠赠。高保真DNA多聚酶pyobest,dNTP及相关的缓冲液,限制性内切酶KpnⅠ，MluⅠ，BglⅡ，XhoⅠ，HindⅢ等，碱性磷酸酶（CIAP），DnaseⅠ(RNA free)及相应缓冲液购自大连TaKaRa公司，连接酶及JM109菌株为美国Promega公司提供。质粒小量抽提试剂盒，PCR产物纯化及胶回收试剂盒为美国Omega产品。细胞转染用脂质体Lipofectamine为美国Invitrogen公司产品。HepG2细胞株为重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室保存并提供。细胞培养用新生牛血清为杭州四季青公司产品。荧光素酶检测试剂盒为美国Promega公司的Dual-luciferase system。RNA提取试剂盒Rneasy mini及RT-PCR试剂盒（一步法）为德国Qiagen公司产品。鼠抗Flag抗体（第一抗体）和FITC标记的羊抗鼠IgG（第二抗体）购自北京中山生物技术公司，其他常用试剂为本室自行配制。
2．方法：（1）质粒的构建：以H/FL为模板，PCR方法分别获得HCV IRES（42～358bp）和NS5A片段；以RL-TK为模板，PCR方法获得Rluc（海肾荧光素酶）片段, 以pEGFP-C1为模板，PCR方法获得CMV启动子片段。其上下游引物依次为5′-AGCGGTACCCCCCTGTGAGGAACTACT-3′和5′-AGCAAGCTTTTAGGATTCGTGCTATG-3′，两端添加BglⅡ和HindⅢ酶切位点；5′-AGAG CTAGCATGTCCGGTTCCTGGCTA-3′和5′-AGTAAGCTTGCAGCACACGACATCTTC-3′，两端添加NheⅠ和HindⅢ酶切位点；5′-AGCACG CGTCACCATGACTTCGAAAGTTT-3′和5′-GGCAGATCTAATTATTGTTCATTTTTGAG-3′，两端添加MluⅠ和BglⅡ酶切位点；上下游引物为5′-GGCGGTACCTAGTTATTAATAGTAATCA AT-3′和5′-ATAACGCGTGATCTGACGGTTCA CTAA-3′，两端添加KpnⅠ和MluⅠ酶切位点。将载体pGL3-enhancer 依次用BglⅡ和HindⅢ,MluI和BglⅡ，KpnⅠ和MluⅠ进行消化，纯化后依次与相应的酶切处理的PCR产物连接。载体pcDNA3.1-3flag用NheⅠ和HindⅢ进行消化，纯化后与酶切处理的NS5A的PCR产物连接。连接产物转化感受态JM109细菌，氨苄青霉素筛选后提取质粒进行酶切鉴定。重组质粒进行DNA序列分析，由本实验室完成。（2）克隆质粒在细胞中的表达：采用1640培养液，添加10%新生牛血清及青霉素和链霉素各100μg/ml,在37℃，5% CO2条件下进行细胞培养及传代。HepG2细胞接种于24孔板，1.0×106/孔，待90%细胞融合后，采用脂质体Lipofectamine试剂盒进行共转染，按说明书操作。每孔质粒总量均为1μg，pCMV-Rlu-IRES-Fluc均转0.2μg，pCDNA3.1-NS5A分别转0、0.2、0.4、0.6、0.8μg，形成不同的浓度梯度，用pCDNA3.1-3flag补齐差量，每种浓度梯度均转3孔。进行荧光素酶（Luc）活性检测时，以帽依赖性方式翻译的海狗肾荧光素酶活性为内参照物，指示转染效率。（3）荧光素酶活性检测：转染后48h收集细胞，用于荧光素酶的检测，具体操作按试剂盒说明书进行，所用仪器为多功能酶标仪。每一质粒同时转染3孔，计算各自比值的平均值并据此作图。（4）细胞免疫荧光方法检测NS5A蛋白的表达：将pcDNA-NS5A质粒及pcDNA3.1-3flag质粒分别转入HepG2细胞，转染后72h收获细胞。4%多聚甲醛固定10min，PBS洗涤，正常山羊血清封闭1h；加第一抗体（鼠抗Flag抗体）孵育1h，PBS洗涤3次；加第二抗体（FITC标记的羊抗鼠IgG）孵育1h，PBS洗涤3次；吸尽液体，中性树胶封闭，荧光显微镜下观察。（5）RT-PCR检测虫荧光素酶mRNA：将pcDNA-NS5A（0.8μg）与pCMV-Rlu-IRES-Fluc（0.2μg）及pcDNA3.1-3flag（0.8μg）与pCMV-Rlu-IRES-Fluc（0.2μg）共转染细胞，48h后收集细胞，RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，并用DnaseⅠ处理，操作按试剂说明书进行。RT-PCR检测荧光素酶基因的mRNA时，以人3′-磷酸甘油醛脱氢酶（hGAPDH）基因为内参照。荧光素酶基因的上游引物为5′-CG TTCGTCACATCTCATCTA-3′,下游引物为5′-ATATCCTTGCCTGATACCTG-3′,扩增产物为524bp（497～1020bp）。hGAPDH的上游引物为5′-GGCTCTCCAGAACATCAT-3′,下游引物为5′-CACCTGGTGCTCAGTGTA-3′,扩增产物为240bp。RT-PCR反应条件为：50℃ 30min，95℃ 15min，94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 50s，循环35次后72℃保温10min。扩增产物采用含EB的15g/L低熔点琼脂糖凝胶，60V电压电泳1h，凝胶成像仪观察并成像。
结 果
1．重组质粒鉴定：pcDNA-NS5A重组质粒用NheI和HingⅢ酶切，产生1343bp的片段，pCMV-Rlu-IRES-Fluc依次用BglⅡ和HindⅢ，MluⅠ和BglⅡ，KpnⅠ和MluⅠ酶切，分别产生316bp，938bp，589bp片段，酶切后电泳结果与预期一致。DNA序列测定结果与相应模板对应区完全一致，证明PCR过程无突变发生。所得克隆质粒及载体基因结构见图1。
2．荧光素酶活性检测结果：将不同剂量的pcDNA-NS5A与pCMV-Rlu-IRES-Fluc共转染HepG2细胞，将未转pcDNA-NS5A组的海肾荧光素酶活性值（Rluc）设定为100%，随着NS5A剂量的逐步增加，Rluc基本保持不变，而HCV IRES启动翻译的虫荧光素酶活性（Fluc）却逐步增高（从160%升至400%），见图2。
3. HCV NS5A蛋白在HepG2细胞中的表达：转染pcDNA-NS5A质粒组细胞内有HCV NS5A蛋白质表达，主要分布在细胞质中。转染pcDNA3.1-3flag组细胞内则无HCV NS5A蛋白质表达，见图3。
4．RT-PCR结果：共转染pcDNA-NS5A组与共转染pcDNA3.1-3flag组均扩增出一条500bp和200bp片段，分别为虫荧光素酶基因片段和hGAPDH（图4），二组虫荧光素酶基因的表达量基本相同，说明HCV NS5A蛋白对虫荧光素酶mRNA的表达无明显影响，进一步证明NS5A蛋白是在翻译水平上起调节作用。
讨 论
真核生物的5′端有一“帽子结构”m7GpppmAp，采用“依赖帽子的扫描机制”（cap-dependent scanning mechanism）翻译，而HCV 5′端没有类似的帽子结构，其翻译机制类似于小RNA病毒的“内部起始”（internal initiation）翻译机制，而HCV IRES是介导启动HCV RNA内部起始翻译的部位，在HCV RNA的翻译及复制过程中发挥着重要作用。
本研究中，我们将HCV IRES插入两个报告基因海肾荧光素酶（Rluc）和虫荧光素酶（Fluc）之间，构建pCMV-Rluc-IRES-Fluc双顺反子，以虫荧光素酶活性的高低来反映HCV IRES的调控功能，以海肾荧光素酶活性的高低反映依赖帽子结构方式启动翻译的水平，并间接反映HCV NS5A蛋白对其的调节作用。实验结果显示在HepG2细胞中，NS5A蛋白的表达能特异的上调HCV IRES启动蛋白翻译的功能，而对依赖帽子结构方式启动的翻译方式无作用。并且，NS5A蛋白对HCV IRES功能的上调作用具有剂量依赖性，随着NS5A蛋白剂量的增加，Fluc活性呈逐步增高趋势。因此，我们可以认为，NS5A蛋白对HCV IRES功能的上调作用取决于NS5A蛋白表达量的绝对高低或NS5A与HCV IRES分子间的相对量。
由于HCV5′UTR DNA序列同样具有启动子活性[3]，所以Fluc活性的增高不能排除NS5A蛋白对其5′UTR的启动子活性（即转录水平）的影响。因此，我们又构建了缺失CMV启动子的重组体，即pCMVdel-Rluc-IRES-Fluc，在与上相同的实验条件下，Fluc活性无明显增加，Rluc无表达（本文未列出数据），因此，NS5A蛋白对其5′UTR的启动子活性的影响可以忽略，进一步说明NS5A蛋白是在翻译的水平上上调HCV IRES的功能。
目前有不少针对HCV非结构蛋白调节HCV IRES介导蛋白翻译的功能的研究报道，但其中也存在争议，并且具体的调节机制以及对HCV复制的影响目前仍知之甚少。He等[4]报道在HCV非结构蛋白中NS5A和NS4B能上调HCV IRES启动蛋白翻译的功能；而Kalliampakou等[5]报道NS5A蛋白对具有抑制作用，并也存在剂量依赖关系。造成这些实验结论差异的原因目前并不清楚，可能与选择不同的HCV的基因型，不同的细胞系，不同的载体，HCV NS5A的用量等实验因素有关。本研究中，HCV NS5A蛋白对其自身的IRES启动蛋白翻译的功能具有正性调节作用，这可能有助于HCV蛋白质的合成及病毒的复制，但其具体的调节机制还有待进一步的研究。值得一提的是脊髓灰质炎病毒的2A蛋白酶能增强病毒自身翻译水平[6]，具体机制可能与引起真核细胞翻译起始因子eIF4G亚单位的裂解有关。因此我们推测HCV NS5A蛋白对其IRES的调节可能通过与宿主细胞某种蛋白相互作用或多种HCV非结构蛋白的共同作用的结果。本实验在构建荧光素酶双顺反子的基础上，通过对HCV NS5A 蛋白对HCV IRES功能的影响的研究，有助于我们更加全面的认识HCV NS5A蛋白在HCV翻译机制中的作用，为我们研究HCV复制的机制提供了新的线索。
参 考 文 献
[1]Shimakami T, Hijikata M, Luo H, et al. Effect of interaction between hepatitis C virus NS5A and NS5B on hepatitis C virus RNA replication with the hepatitis C virus replicon. J Virol, 2004, 78: 2738-2748.
[2]Street A, Macdonald A, Crowder K, et al. The Hepatitis C virus NS5A protein activates a phosphoinositide 3-kinase-dependent survival signaling cascade. J Biol Chem, 2004, 279: 12232-12241.
[3]Chen WX, Zhang J, Huang Y, et al. The promoter activity of the DNA sequence corresponding to HCV 5′UTR in HepG2. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2005, 13: 897-899.
陈维贤,张娟,黄英，等.丙型肝炎病毒5′非翻译区DNA序列在HepG2细胞中的启动子活性.中华肝脏病杂志,2005,13:897-899.
[4]He Y, Yan W, Coito C, et al. The regulation of hepatitis C virus (HCV) internal ribosome-entry site-mediated translation by HCV replicons and nonstructural proteins. J Gen Virol, 2003, 84(Pt 3):535-543.
[5]Kalliampakou KI, Kalamvoki M, Mavromara P. Hepatitis C virus (HCV) NS5A protein downregulates HCV IRES-dependent translation. J Gen Virol, 2005, 86(Pt 4): 1015-1025.
[6]Hambidge SJ, Sarnow P. Translational enhancement of the poliovirus 5′ noncoding region mediated by virus-encoded polypeptide 2A. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89: 10272-10276.
《中华肝脏病杂志》版权 |
