【摘要】目的建立一种简便、快速检测乙型肝炎病毒（HBV）P基因区色氨酰-蛋氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰(YMDD)基序变异混合株组成的检测方法。 方法聚合酶链反应 (PCR)扩增含有YMDD基序的聚合酶（P）基因区片段，将PCR产物捕获至链亲合素包被的微孔板，以探针与PCR产物杂交，该探针3′末端位于待检测变异点上游一位碱基；在4个独立的微孔中分别加入4种荧光素标记的双脱氧核苷酸(Fluorescien－12－ddNTP)及Klenow酶进行单碱基延伸反应；酶标抗荧光素抗体结合Fluorescien－12－ddNTP，加底物显色，测定各孔吸光度，根据公式计算野生株及变异株在混合毒株中所占百分比。结果以野生株和变异株单克隆质粒不同比例混合的标准品，验证本方法可检测混合株中含量少至10%的毒株，模板的适宜浓度范围为100 fg/ml～1 ng/ml。 结论单碱基延伸法是一种简便、快速、灵敏度和特异性较高的点突变检测方法，且可以检测混合株中各成分所占百分比。 【关键词】乙型肝炎病毒；变异；聚合酶基因 A new single nucleotide extension assay for detection of YMDD motif mutation of hepatitis B virusHAO Yong, MIAO Xiaohui，ZHAO Yagang, SUN Dayong.Digestive System Department, General Hospital of Guangzhou Command, 【Abstract】ObjectiveTo develop a easy, rapid assay to detect YMDD motif mutation in polymerase gene of hepatitis B virus (HBV) and analyse the percentage of each mutant strain. MethodsHBV DNA were amplified with primers spanning the HBV YMDD motif. The positive strand of PCR product was biotinlabelled by a 【Key words】Hepatitis virus, typ B Mutation Polymerase gene 长期应用拉米夫定抗HBV治疗后，HBV DNA P基因区可出现YMDD基序变异［1, 2］，常见YMDD基序变异分别是：A 材 料 与 方 法 一、 材料 引物及探针均由上海生物工程公司合成(见表1)。微反应板的制备按照仝文斌报道方法［3］操作。野生株及变异株标准品则选取YMDD基序741位碱基为A及G的HBV DNA阳性血清，以Y3U、Y3D引物扩增后，连接入质粒pCR-R2.1，再转化入大肠杆菌DH5α，选取单克隆菌落增殖后，抽提纯化，经测序确定2株克隆质粒纯品，1株YMDD基序741位为A（野生株，W），另1株为G（变异株、M），产物用紫外线分光精确定量后，将二者以1∶1、1∶2、1∶3、1∶5 、1∶7、1∶9、1∶11及1∶13不同比例混合，以TE缓冲液稀释并制成10 fg/ml～1 ng/ml浓度梯度，获得混合株标准品。96孔微反应板购自晶美生物工程有限公司；4种Fluorescein-12-ddNTP购自PerkinElmer公司；辣根过氧化物酶标记抗荧光素抗体购于宝灵曼公司。 二、方法 (一) P基因区第741位核苷酸多态性检测取3μl混合株标准品作为模板，总反应体积50μl，引物Bio-Y2U、Y2D，反应条件：解链 PCR产物以PBST缓冲液（PBS缓冲液中加1%Tween20，0.1% Proclin 300）10倍稀释，分别加入4个微孔中，每孔25μl， (二) P基因区第741位核苷酸多态性检测与第743位同时进行，步骤相同，但探针引物为PY2。 (三) 结果判定“B”代表对背景吸光度值，“A450ddNTP”表示加Fluorescein-12-ddNTP孔的A450值 1. 第741位碱基变异检测结果的计算公式 公式一：B=(A450ddATP+A450ddGTP)/2 公式二：野生株在混合株中的百分比 W%=lg(A450ddUTPB)lg(A450ddUTP-B)+lg(A450ddCTP-B)×100% 公式三：变异株在混合株中的百分比 M%=lg(A450ddCTP-B)lg(A450ddUTP-B)+lg(A450ddCTP-B)×100% 2. 第743位碱基变异检测结果的计算公式 公式一：B=(A450ddGTP+A450ddUTP)/2 公式二：野生株在混合株中的百分比 W%=lg(A450ddUTPB)lg(A450ddUTP-B)+lg(A450ddATP-B)×100% 公式三：变异株在混合株中的百分比 M%=lg(A450ddATP-B)lg(A450ddCTP-B)+lg(A450ddATP-B)×100% 四、统计学方法 采用Student’s t检验。表1（略） 一、灵敏度 当弱势株在混合株中≥10%时，在100 fg/ml～1 ng/ml之间，本实验检测结果与标准品实际值相符合，P＞0.05。但在质粒浓度超过100 pg/ml时，PCR循环数应小于30，否则酶标显色强阳性并超出检测范围。质粒浓度低于100 pg/ml时，酶标信号弱，如将PCR增加至38循环，变异株和野生株百分比检测值波动较大，与实际值差别显著。另外，当弱势株在混合株中比例＜10%时，检测值与实际值差异显著。 二、特异性 非特异扩增片段检测以CU、Bio-CD引物，HBV DNA质粒为模板，PCR扩增32个循环，得到1636～2054位置的418 bp长产物作为对照，检测后均未出现阳性结果，表明仅有特异性片段与探针杂交被检测。 三、重复性 将同一份混合株标准品分为10份进行检测，根据各野生株及变异株百分比检测值，计算得CV＝9.7%。 讨 论 本方法是在Ballard等［4］实验的基础上进行改进，并用于检测HBV YMDD基序变异。Ballard等用Taq酶进行单碱基延伸，但Taq酶无3′-5′端的外切校正活性，其错配率较高，其次Taq酶具有非特异性地在核酸末尾延伸A的活性，其检测准确性和特异性都有限，因而本实验采用了Klenow酶而非Taq酶进行单碱基延伸反应。实验通过克隆质粒获得含YMDD基序野生株及变异株HBV DNA片段的纯品，以不同比例混合制成标准品，确定本方法检测混合株中少至10%的毒株，更具有可信度，表明本方法检测敏感度较高，可检测在混合株中数量≥10%时的弱势株。 HBV YMDD基序发生蛋氨酸（M）→异亮氨酸（I）或蛋氨酸（M）→缬氨酸（V）的变异后，出现对HBV治疗药物拉米夫定的耐药性。此时，实验室检查常见丙氨酸氨基转移酶升高，HBV DNA反弹，少数患者甚至发生重型肝炎。有学者报道［5, 6］，在未用拉米夫定治疗的乙型肝炎患者血清中亦检测出YMDD变异株，表明变异者在使用拉米夫定治疗时，较早发生耐药。所以，在用拉米夫定抗HBV治疗前及治疗中，需监测YMDD变异。目前YMDD基序变异的主要检测方法为直接测序法，但其测序结果仅能显示混合株中占优势的野生株或变异株碱基性质，而在出现YMDD变异早期，变异株数量尚少于野生株时，用测序法则难以检测出。本方法通过8个微孔分别检测YMDD最常见的2个变异位点的核苷酸性质，只要变异株数量超过10%时，即可出现阳性结果，可早期发现HBV YMDD基序的变异，并且可计算出变异株在混合株中所占百分比。本实验延伸反应混合液中加入的为荧光素－双脱氧核苷酸(ddNTP-Fluorescin)，在碱基配对时延伸，而且仅能延伸一个碱基，保证了待测目的碱基数量与反应信号之间存在一固定比值，因而可以进行定量检测各毒株在混合株中所占百分比。除测序法外，其他常用于检测单核苷酸多态性（SNPs）的方法还有限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)和扩增抗拒点突变检测系统(ARMS)等，但仅本方法可定量地检测突变株及野生株在混合毒株中所占的百分比。 核苷类似物是目前临床上治疗乙型肝炎的重要抗病毒药物，但长期治疗发生病毒耐药是此类药物面临的共同问题。目前体内外实验均证明耐药性的产生与HBV P基因变异有关，不同的核苷（酸）类似物耐药株的变异位点并不一致，如拉米夫定耐药相关突变位点为M204V/I、L 参 考 文 献 1Ling R, Mutimer D, Ahmed M， et al. Selection of mutations in the hepatitis B virus polymerase during therapy of transplant recipients with lamivudine. Hepatology, 1996，24∶711－713. 2Tipples GA, Ma MM, Fischer KP. et al. Mutation in HBV RNAdependent DNA polymerase confers resistance to lamivudine in vivo. Hepatology, 1996，24∶714－717. 3仝文斌，张泰英，费然，等. 酶免疫法检测丙型肝炎病毒RNA的聚合酶链反应产物. 中华医学检验杂志，1998,21∶88－91. 4Ballard AL, Boxall EH. Colourimetric point mutation assay: for detection of precore mutants of hepatitis B. J Virol Methods, 1997,67∶143－152. 5Kobayashi S, Ide T, Sata M. Detection of YMDD motif mutations in some lamivudineuntreated asymptomatic hepatitis B virus carriers. J Hepatol, 2001, 34∶584－586. 6霍红，赵书民，蔡雄，等. YMDD自然变异毒株流行病学调查. 肝脏， 2006,4∶232－234. 上海《肝脏》杂志社版权 |