【关键词】 癌，肝细胞； 变异（遗传学）； nm23H1基因
Genetic instability of nm23H1 gene and invasion and/or metastasis of hepatocellular carcinoma ZHONG Jian-ping, LU Hai-ying, LI Ji-cheng.
【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Variation (Genetics); nm23H1 gene
【First author's address】 Shaoxing Sixth People's Hospital, Shaoxing 312000, China
Corresponding author: LI Ji-cheng, Emali: lijichen@ zju.edu.cn
大量研究表明基因的遗传不稳定性，如基因的微卫星不稳定性（MSI）和杂合性缺失（LOH）可能是产生基因突变，导致抑癌基因功能失调，引起肿瘤发生和转移的重要因素。本实验采用PCR-SSCP与免疫组织化学染色技术，对HCC的nm23H1基因D17S396位点的MSI和LOH，以及nm23H1蛋白表达进行检测，分析D17S396位点的遗传不稳定性，对HCC中nm23H1基因表达和肿瘤侵袭转移的影响，为揭示nm23H1基因作用机制、肿瘤侵袭转移机制及预后判断提供实验依据。
一、材料与方法
1. 材料：石蜡包埋HCC组织48例，每例均包括肿瘤组织和周围正常组织。患者年龄33～80岁，术前均未接受任何放疗或化疗。D17S396位点引物序列来自相关文献[1]：5′-TTGACCGGGGTAGAGAACTC-3′和5′-TCTCA GTACTTCCCGTGACC-3′，由上海生工生物工程公司合成。小鼠抗人nm23H1蛋白单克隆抗体（Gene Tech），羊抗鼠Envision复合物（丹麦DAKO公司）。
2. 方法：（1）基因组DNA的抽提：石蜡包埋组织10μm切片，切片脱蜡后，用苯酚/氯仿抽提法，提取肿瘤组织基因组DNA和肿瘤周围正常组织基因组DNA。（2）D17S396位点的PCR扩增，扩增产物经20g/L琼脂糖电泳、溴乙锭染色，证实PCR扩增成功。扩增产物片段长为96～104bp。（3）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。（4）变性聚丙烯酰胺凝胶染色。（5）石蜡包埋组织免疫组织化学染色，DAB显色。（6）判断标准：HCC周围正常组织基因组DNA，D17S396位点的PCR-SSCP电泳凝胶图中，只出现1条主带代表1个等位基因片段，为纯合子；如出现两条主带则为杂合子，可用于LOH分析。肿瘤组织条带较正常组织相应等位基因条带减少或密度降低50%以上，为LOH；肿瘤组织条带较正常组织等位基因条带增多或移位，为MSI。对48例HCC制定观察侵袭转移倾向条件：肝门淋巴结转移；肝内肿瘤数目≥2个；门静脉癌栓形成；癌周多个卫星结节形成；癌组织浸润破坏肿瘤包膜。凡符合上述条件中的两项或两项以上者定为侵袭转移倾向高危组，仅有其中某一项或全无者定为侵袭转移倾向低危组。（7）图像分析：每例标本连续选取不重叠的20个高倍视野，由Leica-Qwin计算机图像分析系统，在相同灰度设定条件下测出GA（整个背景视野灰度值）、Ga（视野内nm23H1蛋白免疫组织化学阳性染色颗粒的灰度值）、AAa（nm23H1阳性细胞占视野面积的面积密度）。（8）数据处理：用Excel函数算出PU值（positive unit阳性单位），代表nm23H1蛋白在肝脏肿瘤细胞的表达强度。255为Leica-Qwin的最大灰度分级。PU＝|Ga-GA|/［（1-AAa）×255］×100%。
3. 统计学分析：应用SPSS12.0软件，行单因素方差分析（One-Way ANOVA）和t检验。
二、结果
1. MSI和LOH检出结果：实验组和对照组D17S396位点微卫星片段均扩增成功。经10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,其等位基因均为杂合子，可用于MSI和LOH分析。与正常组织比较,MSI表现为肿瘤组织等位基因条带增加；LOH则是肿瘤组织等位基因条带减少（图1）。实验结果表明，HCC组织中D17S396位点遗传不稳定发生率为35.4%，LOH的检出率为22.9%，与肿瘤的有无淋巴结或远处转移和有无肝内转移或门静脉栓密切相关；在有淋巴结或远处转移的癌组织中发生率为45.0%，显著高于未发生淋巴结或远处转移的7.1%（P<0.01）；在有肝内转移或门静脉栓的癌组织中发生率为53.3%，显著高于未发生肝内转移或门静脉栓的9.1%（P<0.01）。此外，侵袭转移高危组LOH的检出率为45.0%，显著高于低危组（7.1%）（P<0.01）。MSI检出率为12.5%，其组间差异不明显（P>0.05）（表1）。
2. nm23H1蛋白免疫组织化学结果：nm23H1蛋白免疫组织化学染色为棕黄色颗粒，主要位于细胞质，细胞膜和细胞核也可有阳性反应结果（图2）。而以PBS代替第一抗体的阴性对照染色结果为阴性（图3）。在48例HCC组织中，nm23H1蛋白阳性率为56.3%。在无淋巴或远处转移组的nm23H1蛋白阳性率为82.1%，明显高于有淋巴或远处转移组的20.0%（P<0.01）。HCC侵袭转移低危组nm23H1蛋白阳性率为78.6%，显著高于高危组25.0%（P<0.01），nm23H1蛋白阳性率与HCC的有无肝内转移或门静脉栓无关，经Leica-Qwin计算机图像分析显示，在各临床病理参数的影响下，nm23H1蛋白的表达强度差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。
3. HCC nm23H1基因D17S396位点MSI和LOH与nm23H1蛋白表达关系：48例HCC中LOH阳性组nm23H1蛋白阳性率为27.3%（3/11），明显低于LOH阴性组的（24/37）64.9%（P< 0.05）。但MSI对nm23H1蛋白的表达无影响。
三、讨论
在淋巴结或远处转移组和肝内转移或门静脉栓组的LOH发生率分别高于无淋巴结或远处转移组和肝内转移或门静脉栓组（P<0.01）；HCC侵袭转移高危组LOH检出率显著高于侵袭转移低危组。可见，随着淋巴结或远处转移和肝内转移或门静脉癌栓的发生，LOH发生率增加。HCC门静脉癌栓的形成，转移的出现是预示肝癌晚期的重要特征，提示D17S396位点LOH多发生于HCC晚期，并有促进转移和远处浸润的作用。此外，LOH与HCC侵袭转移潜能正相关，随着LOH发生率增加，肿瘤侵袭转移的危险性增高，预后变差。因此，LOH检测可作为HCC恶性程度、转移和预后判断的重要判断指标，并有助于预测转移复发的高危患者。Yoshida等[2]对胆囊癌发生机制的研究发现，MSI多发生在预后较好的临床早期癌组织中，并认为MSI可作为早期分子诊断的标志。而我们对HCC的研究结果并没有表现出这样的关系，这种研究结果的差异，可能与肿瘤组织的不同有关。实验中MSI和LOH对HCC临床病理表型作用的差异，表明MSI和LOH可能通过不同的途径调控HCC的发生和转移[3]。
实验分析发现，HCC的nm23H1蛋白表达，随着淋巴结或远处转移的发生和侵袭转移潜能的升高而显著降低。这表明nm23H1蛋白表达降低，使其抑癌作用减弱或消失，在HCC的恶性程度、侵袭转移和临床进展过程中起着重要的促进作用，并通过对其他肝癌相关基因失调控作用，从而促进肝癌的发生以及侵袭性的增加。因此，我们认为，增加肿瘤局部nm23H1蛋白的表达，可减缓肿瘤的转移，延缓肿瘤进展，改善预后。有文献报道，基因的遗传性突变可能是抑癌基因功能失调和编码蛋白量减少的重要机制之一[4]。实验结果可见，D17S396位点LOH可能导致了nm23H1抑癌基因的缺失或变异，从而抑制HCC局部nm23H1蛋白的表达，进而引起HCC的高转移、高侵袭、低预后。而nm23H1蛋白阳性率在MSI阳性组和MSI阴性组之间无差异，其中的机制有待进一步深入研究。
参 考 文 献
[1]Berney CR, Fisher RJ, Yang J, et al. Genomic alterations (LOH, MI) on chromosome 17q21-23 and prognosis of sporadic colorectal cancer. Int J Cancer, 2000, 89: 1-7.
[2]Yoshida T, Sugai T, Habano W, et al. Microsatellite instability in gallbladder carcinoma: two independent genetic pathways of gallbladder carcinogenesis. J Gastroenterol, 2000, 35: 768-774.
[3]Cong WM, Zhang SH, Xian ZH, et al. Study on loss of heterozygosity and microsatellite instability in hepatocellular carcinoma. Zhonghua Binglixue Zazhi, 2005, 34: 71-74.
丛文铭,张树辉,冼志红,等.肝细胞癌肿瘤抑制基因的杂合性缺失和微卫星不稳定性研究.中华病理学杂志，2005,34:71-74.
[4]Gross-Goupil M, Riou P, Emile JF, et al. Analysis of chromosomal instability in pulmonary or liver metastases and matched primary hepatocellular carcinoma after orthotopic liver transplantation. Int J Cancer, 2003, 104: 745-751.
nm23H1基因遗传不稳定性与肝细胞癌侵袭转移的关系
钟建平 卢海英 李继承
【关键词】 癌，肝细胞； 变异（遗传学）； nm23H1基因
Genetic instability of nm23H1 gene and invasion and/or metastasis of hepatocellular carcinoma ZHONG Jian-ping, LU Hai-ying, LI Ji-cheng.
【Key words】 Carcinoma, hepatocellular; Variation (Genetics); nm23H1 gene
【First author's address】 Shaoxing Sixth People's Hospital, Shaoxing 312000, China
Corresponding author: LI Ji-cheng, Emali: lijichen@ zju.edu.cn
大量研究表明基因的遗传不稳定性，如基因的微卫星不稳定性（MSI）和杂合性缺失（LOH）可能是产生基因突变，导致抑癌基因功能失调，引起肿瘤发生和转移的重要因素。本实验采用PCR-SSCP与免疫组织化学染色技术，对HCC的nm23H1基因D17S396位点的MSI和LOH，以及nm23H1蛋白表达进行检测，分析D17S396位点的遗传不稳定性，对HCC中nm23H1基因表达和肿瘤侵袭转移的影响，为揭示nm23H1基因作用机制、肿瘤侵袭转移机制及预后判断提供实验依据。
一、材料与方法
1. 材料：石蜡包埋HCC组织48例，每例均包括肿瘤组织和周围正常组织。患者年龄33～80岁，术前均未接受任何放疗或化疗。D17S396位点引物序列来自相关文献[1]：5′-TTGACCGGGGTAGAGAACTC-3′和5′-TCTCA GTACTTCCCGTGACC-3′，由上海生工生物工程公司合成。小鼠抗人nm23H1蛋白单克隆抗体（Gene Tech），羊抗鼠Envision复合物（丹麦DAKO公司）。
2. 方法：（1）基因组DNA的抽提：石蜡包埋组织10μm切片，切片脱蜡后，用苯酚/氯仿抽提法，提取肿瘤组织基因组DNA和肿瘤周围正常组织基因组DNA。（2）D17S396位点的PCR扩增，扩增产物经20g/L琼脂糖电泳、溴乙锭染色，证实PCR扩增成功。扩增产物片段长为96～104bp。（3）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。（4）变性聚丙烯酰胺凝胶染色。（5）石蜡包埋组织免疫组织化学染色，DAB显色。（6）判断标准：HCC周围正常组织基因组DNA，D17S396位点的PCR-SSCP电泳凝胶图中，只出现1条主带代表1个等位基因片段，为纯合子；如出现两条主带则为杂合子，可用于LOH分析。肿瘤组织条带较正常组织相应等位基因条带减少或密度降低50%以上，为LOH；肿瘤组织条带较正常组织等位基因条带增多或移位，为MSI。对48例HCC制定观察侵袭转移倾向条件：肝门淋巴结转移；肝内肿瘤数目≥2个；门静脉癌栓形成；癌周多个卫星结节形成；癌组织浸润破坏肿瘤包膜。凡符合上述条件中的两项或两项以上者定为侵袭转移倾向高危组，仅有其中某一项或全无者定为侵袭转移倾向低危组。（7）图像分析：每例标本连续选取不重叠的20个高倍视野，由Leica-Qwin计算机图像分析系统，在相同灰度设定条件下测出GA（整个背景视野灰度值）、Ga（视野内nm23H1蛋白免疫组织化学阳性染色颗粒的灰度值）、AAa（nm23H1阳性细胞占视野面积的面积密度）。（8）数据处理：用Excel函数算出PU值（positive unit阳性单位），代表nm23H1蛋白在肝脏肿瘤细胞的表达强度。255为Leica-Qwin的最大灰度分级。PU＝|Ga-GA|/［（1-AAa）×255］×100%。
3. 统计学分析：应用SPSS12.0软件，行单因素方差分析（One-Way ANOVA）和t检验。
二、结果
1. MSI和LOH检出结果：实验组和对照组D17S396位点微卫星片段均扩增成功。经10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,其等位基因均为杂合子，可用于MSI和LOH分析。与正常组织比较,MSI表现为肿瘤组织等位基因条带增加；LOH则是肿瘤组织等位基因条带减少（图1）。实验结果表明，HCC组织中D17S396位点遗传不稳定发生率为35.4%，LOH的检出率为22.9%，与肿瘤的有无淋巴结或远处转移和有无肝内转移或门静脉栓密切相关；在有淋巴结或远处转移的癌组织中发生率为45.0%，显著高于未发生淋巴结或远处转移的7.1%（P<0.01）；在有肝内转移或门静脉栓的癌组织中发生率为53.3%，显著高于未发生肝内转移或门静脉栓的9.1%（P<0.01）。此外，侵袭转移高危组LOH的检出率为45.0%，显著高于低危组（7.1%）（P<0.01）。MSI检出率为12.5%，其组间差异不明显（P>0.05）（表1）。
2. nm23H1蛋白免疫组织化学结果：nm23H1蛋白免疫组织化学染色为棕黄色颗粒，主要位于细胞质，细胞膜和细胞核也可有阳性反应结果（图2）。而以PBS代替第一抗体的阴性对照染色结果为阴性（图3）。在48例HCC组织中，nm23H1蛋白阳性率为56.3%。在无淋巴或远处转移组的nm23H1蛋白阳性率为82.1%，明显高于有淋巴或远处转移组的20.0%（P<0.01）。HCC侵袭转移低危组nm23H1蛋白阳性率为78.6%，显著高于高危组25.0%（P<0.01），nm23H1蛋白阳性率与HCC的有无肝内转移或门静脉栓无关，经Leica-Qwin计算机图像分析显示，在各临床病理参数的影响下，nm23H1蛋白的表达强度差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。
3. HCC nm23H1基因D17S396位点MSI和LOH与nm23H1蛋白表达关系：48例HCC中LOH阳性组nm23H1蛋白阳性率为27.3%（3/11），明显低于LOH阴性组的（24/37）64.9%（P< 0.05）。但MSI对nm23H1蛋白的表达无影响。
三、讨论
在淋巴结或远处转移组和肝内转移或门静脉栓组的LOH发生率分别高于无淋巴结或远处转移组和肝内转移或门静脉栓组（P<0.01）；HCC侵袭转移高危组LOH检出率显著高于侵袭转移低危组。可见，随着淋巴结或远处转移和肝内转移或门静脉癌栓的发生，LOH发生率增加。HCC门静脉癌栓的形成，转移的出现是预示肝癌晚期的重要特征，提示D17S396位点LOH多发生于HCC晚期，并有促进转移和远处浸润的作用。此外，LOH与HCC侵袭转移潜能正相关，随着LOH发生率增加，肿瘤侵袭转移的危险性增高，预后变差。因此，LOH检测可作为HCC恶性程度、转移和预后判断的重要判断指标，并有助于预测转移复发的高危患者。Yoshida等[2]对胆囊癌发生机制的研究发现，MSI多发生在预后较好的临床早期癌组织中，并认为MSI可作为早期分子诊断的标志。而我们对HCC的研究结果并没有表现出这样的关系，这种研究结果的差异，可能与肿瘤组织的不同有关。实验中MSI和LOH对HCC临床病理表型作用的差异，表明MSI和LOH可能通过不同的途径调控HCC的发生和转移[3]。
实验分析发现，HCC的nm23H1蛋白表达，随着淋巴结或远处转移的发生和侵袭转移潜能的升高而显著降低。这表明nm23H1蛋白表达降低，使其抑癌作用减弱或消失，在HCC的恶性程度、侵袭转移和临床进展过程中起着重要的促进作用，并通过对其他肝癌相关基因失调控作用，从而促进肝癌的发生以及侵袭性的增加。因此，我们认为，增加肿瘤局部nm23H1蛋白的表达，可减缓肿瘤的转移，延缓肿瘤进展，改善预后。有文献报道，基因的遗传性突变可能是抑癌基因功能失调和编码蛋白量减少的重要机制之一[4]。实验结果可见，D17S396位点LOH可能导致了nm23H1抑癌基因的缺失或变异，从而抑制HCC局部nm23H1蛋白的表达，进而引起HCC的高转移、高侵袭、低预后。而nm23H1蛋白阳性率在MSI阳性组和MSI阴性组之间无差异，其中的机制有待进一步深入研究。
参 考 文 献
[1]Berney CR, Fisher RJ, Yang J, et al. Genomic alterations (LOH, MI) on chromosome 17q21-23 and prognosis of sporadic colorectal cancer. Int J Cancer, 2000, 89: 1-7.
[2]Yoshida T, Sugai T, Habano W, et al. Microsatellite instability in gallbladder carcinoma: two independent genetic pathways of gallbladder carcinogenesis. J Gastroenterol, 2000, 35: 768-774.
[3]Cong WM, Zhang SH, Xian ZH, et al. Study on loss of heterozygosity and microsatellite instability in hepatocellular carcinoma. Zhonghua Binglixue Zazhi, 2005, 34: 71-74.
丛文铭,张树辉,冼志红,等.肝细胞癌肿瘤抑制基因的杂合性缺失和微卫星不稳定性研究.中华病理学杂志，2005,34:71-74.
[4]Gross-Goupil M, Riou P, Emile JF, et al. Analysis of chromosomal instability in pulmonary or liver metastases and matched primary hepatocellular carcinoma after orthotopic liver transplantation. Int J Cancer, 2003, 104: 745-751.
上海《肝脏》杂志社版权 |
