【关键词】 肝纤维化； 血吸虫病； 干扰素α；干扰素γ
A comparison of therapeutic outcomes in liver fibrosis of murine schistosomiasis japonica with interferon-alpha and interferon-gamma WANG Wei-ya, LI Fei, JIA Xue-mei, WANG Hong, LI Cui-ying, JIN Liang.
【Key words】 Hepatic fibrosis; Schistosomiasis; Interferon alpha; Interferon gamma
【First author's address】 Department of Parasitology, Kunming Medical College, Kunming 650031, China
Corresponding author: LI Fei, Email: lfei06@ sohu.com 血吸虫病肝纤维化引起的上消化道大出血、肝性脑病等并发症是患者死亡的主要原因，研究有效药物阻断肝纤维化的发展是提高该病预后的关键。现已证明，血吸虫病肝纤维化在有效杀虫治疗后，仍需有效的抗肝纤维化治疗[1]。由于诸多细胞因子在肝纤维化发生、发展中起重要作用，细胞因子调节剂被认为是最有前途的抗肝纤维化药物种类之一[2]。已有学者用IFNγ治疗日本血吸虫病肝纤维化并取得了肯定疗效[3]。IFNα是否也具有此种作用，国内鲜见报道。本研究用IFNα-1b治疗小鼠日本血吸虫病肝纤维化，并与IFNγ进行比较，通过观察小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均大小、胶原沉积及肝纤维化程度SSS评分等指标，评价IFNα的疗效。
一、材料与方法
1. 实验动物：日本血吸虫尾蚴, 取自江苏省血吸虫病防治研究所提供的中间宿主湖北肋壳钉螺。成年雄性IcR小鼠，体重20～25g，100只，购自昆明医学院实验动物中心。正常对照组 (10周，18周)各10只，体重分别为（46.01±3.62）g和（42.53±3.39）g，模型对照组 (10周)、IFNα治疗组（18周）、IFNγ治疗组（18周）和等渗盐水对照组（18周）各20只，体重分别为（40.94±6.66）g、（46.05±4.28）g、（45.27±2.83）g和（44.80±4.51）g。
2. 药物、试剂及仪器：注射用重组人IFNα-1b[深圳科兴生物工程股份有限公司生产，10μg（100MU）, 批号为20050101]、注射用重组人IFNγ（克隆伽玛，购自上海克隆生物高技术有限公司，100MU，批号为20050101）、0.9%氯化钠注射液（昆明制药厂，10ml/支，批号为20050726）、10%甲醛溶液、无水乙醇。光学显微镜、天平、电脑图像分析系统（Nikon eclipse 50i）等由昆明医学院人体寄生虫学教研室提供。
3．动物分组及处理：100只IcR小鼠随机平均分为正常对照组、模型对照组、IFNα治疗组、IFNγ治疗组和等渗盐水对照组5组。逸出尾蚴，经腹部皮肤注射感染除正常对照组外的80只小鼠[每鼠感染尾蚴（20±2）条]。10周后，随机抽取正常对照组中的10只小鼠，称取体重；每鼠均取相同部位的肝左叶组织2块，每块组织约1.0cm×1.0cm×0.5cm大小，立即放入10%甲醛溶液中固定保存备检。同法处理模型对照组20只小鼠。其余3组感染小鼠每鼠以吡喹酮（100mg/kg）一次性灌胃，杀死小鼠体内的血吸虫成虫。次日，IFNα治疗组的每只小鼠予以IFNα-1b 500U?g-1?d-1于颈背部皮下注射（容量为0.1ml）；IFNγ治疗组每鼠予以等剂量的IFNγ皮下注射（容量为0.1ml）；等渗盐水对照组每鼠予以0.9%氯化钠注射液0.1ml/d皮下注射。用药8周后，同法处理所有剩余小鼠；检查感染小鼠门静脉系静脉内是否有成虫存活。
4. 病变观察及疗效判定：（1）各感染组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均大小：一块肝组织做石蜡包埋、连续切片（厚度为4μm），苏木素-伊红（HE）染色，在光镜下用目镜测微器（100×）测量虫卵肉芽肿面积，求取平均值（每张切片均观察其4个角和中央处共5处视野，测量每个视野内虫卵肉芽肿面积；虫卵肉芽肿面积=最大纵径×最大横径、平均肉芽肿面积=所测量的肉芽肿面积之和/所测量的肉芽肿数目）。（2）各组小鼠肝脏胶原面积百分比：另一块肝组织切片做苦味酸-酸性品红（VG）染色，显示肝脏中胶原纤维，用电脑图像分析系统（100×）观察、分析肝脏内胶原沉积情况；每张切片均选取其4个角和中央处共5处视野，计算每个视野中胶原纤维所占的面积百分比（%），求出5个视野的平均值（x-±s）。（3）各感染组小鼠肝纤维化SSS评分：用VG染色切片进行观察，采用卫生部血吸虫病专家咨询委员会推荐的《慢性肝炎肝纤维化半定量计分（SSS）方案》（显效：肝纤维化SSS评分较治疗前下降≥5分；有效：肝纤维化SSS评分较治疗前下降≥2分；无效：未达到有效标准者）[4]，对小鼠肝脏纤维化病变程度进行评分并做统计学分析，判定IFNα和IFNγ的疗效。
5． 统计学处理：应用SPSS13.0统计分析软件分析所得数据。计量资料均采用方差分析检验（检验水准为α=0.05）。
二、结果
1. 肝纤维化模型制作情况：尾蚴感染10周后，小鼠门静脉系统血管内可见合抱或单条存在的血吸虫成虫。肝小叶内及门管区均可见大量虫卵沉积及急慢性虫卵肉芽肿形成；肝小叶结构紊乱；门管区因肉芽肿形成、胶原纤维组织增生及炎细胞浸润而明显扩大、变形；增生的纤维组织主要沿门管区走行分布，形成所谓的干线型纤维化，部分纤维条索向小叶内延伸，与小叶内病灶相连，形成纤维间隔。
2. 吡喹酮杀虫效果：经吡喹酮100mg/kg一次性灌胃杀虫治疗后，IFNα治疗组、IFNγ治疗组和等渗盐水对照组各小鼠门静脉系统血管内均未见存活的血吸虫成虫。（1）各感染组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均大小：治疗后，模型对照组（10周）、IFNα治疗组（18周）、IFNγ治疗组（18周）、等渗盐水对照组（18周）小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均大小分别为（0.18±0.04）mm3、（0.11±0.04）mm3、（0.11±0.06）mm3、（0.24±0.05）mm3。IFNα治疗组和IFNγ治疗组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均大小均较模型对照组明显缩小（P值均＜0.05）；等渗盐水对照组则较模型对照组进一步增大（P＞0.05）；IFNα治疗组与IFNγ治疗组相比无明显差异（P＞0.05）。（2）各组小鼠肝脏胶原面积百分比：经方差齐性检验，F＝9.47, P<0.05，方差不齐。作对数转换（lgx）后方差齐性。IFNα治疗组和IFNγ治疗组小鼠肝脏胶原面积较模型对照组及等渗盐水对照组显著降低（P值分别为0.026、0.021、0.002和0.000），但仍显著大于正常对照组（P值均＜0.05）；IFNα治疗组小鼠肝脏胶原面积略大于IFNγ治疗组（P＞0.05）；等渗盐水对照组则较模型对照组进一步增大（P＞0.05），见表1。（3）各感染组小鼠肝纤维化SSS评分：模型对照组（10周）、IFNα治疗组（18周）、IFNγ治疗组（18周）、等渗盐水对照组（18周）小鼠肝纤维化SSS评分分别为6.75±1.50、3.17±1.33、3.88±1.65、9.33±3.21。IFNα治疗组和IFNγ治疗组小鼠肝脏病变SSS评分均较模型对照组明显下降 （P值均＜0.05）, 且显著低于等渗盐水对照组（P值均＜0.01）；等渗盐水对照组SSS评分较模型对照组增高但差异无统计学意义（P＞0.05）；IFNα治疗组与IFNγ治疗组差异没有统计学意义（P＞0.05）。
表1 （略） 三、 讨论
本实验用IFNα-1b来治疗小鼠日本血吸虫病肝纤维化，并与疗效肯定的IFNγ进行比较以观察IFNα的疗效，结果显示与模型对照组和等渗盐水对照组相比，IFNα治疗组和IFNγ治疗组小鼠肝组织中浸润的炎症细胞减少、虫卵肉芽肿结节变小，说明二者均可通过抑制肝脏虫卵肉芽肿炎症反应而减轻肝纤维化；两个IFN治疗组小鼠肝脏内沉积的胶原纤维明显减少，表明二者均可显著抑制肝脏中的胶原沉积；两个IFN治疗组小鼠肝纤维化程度SSS评分均较治疗前的模型对照组下降>2分，达到治疗有效标准，且差异有统计学意义，表明二者治疗小鼠日本血吸虫病肝纤维化均有效。两种IFN在降低病鼠肝脏虫卵肉芽肿大小、减少肝脏内胶原沉积及降低肝纤维化程度SSS评分三个方面均无统计学差异，表明二者抗小鼠日本血吸虫病肝纤维化的疗效相近。当前国内IFNα的市场价格仅为IFNγ的1/3左右，用IFNα治疗血吸虫病肝纤维化可明显减轻患者的经济负担。
本研究结果还提示：IFNα治疗尚不能使小鼠肝脏内胶原面积和肝纤维化程度SSS评分回复至正常水平，说明用IFNα-1b 500U?g-1?d-1治疗8周不能完全逆转小鼠日本血吸虫病肝纤维化；增大用药剂量或（和）延长用药时间能否完全逆转小鼠日本血吸虫病肝纤维化，尚待进一步研究证实。与模型对照组相比，等渗盐水对照组小鼠肝脏病变进一步加重，说明血吸虫病肝纤维化在有效杀虫治疗后仍会自行发展，这与文献报道一致[1, 5]。两组间疗效差异无统计学意义可能与观察时间较短有关；IFNα治疗日本血吸虫病肝纤维化患者的确切疗效及其机制均有待进一步验证。
参 考 文 献
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[3]Zhang LH, Yao HP, Cao XT, et al. Effects of IFN-γ gene-modified hepatocytes on TGF-β1 and its receptor in mice infected with Schistosoma japonicum. Zhongguo Jishengchongxue Yu Jishengchongbing Zazhi, 1999, 17: 330-333.
张立煌,姚航平,曹雪涛,等.γ-干扰素基因修饰肝细胞对感染日本血吸虫小鼠TGF-β1及其受体的影响.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1999,17:330-333.
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乌文琳,蔡卫民,陈名刚.日本血吸虫病肝纤维化诊断与疗效评估方案（草）.中国血吸虫病防治杂志,2004,16:229-230.
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张志安,石淑仙,黄元诚,等.复方中药对兔血吸虫病肝纤维化指标的影响.华中科技大学学报(医学版),2003,32:174-177. 《中华肝脏病杂志》版权 |
