【摘要】目的1例拉米夫定耐药患者在接受恩替卡韦治疗过程中出现恩替卡韦耐药相关性变异，继续治疗后恩替卡韦耐药株自动消失，并发生HBeAg血清学转换，对该例患者HBV耐药株的动态变化进行了动态观察。方法收集该患者的系列血清标本及血清HBV DNA、转氨酶等系列临床数据，采用血清HBV DNA的PCR扩增与直接测序，限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析，RT序列的克隆与测序等方法，检测HBV耐药株的比例及动态变化。结果该患者在应用恩替卡韦治疗前就已经存在拉米夫定耐药株(rtL 【关键词】乙型肝炎病毒； 慢性乙型肝炎； 拉米夫定耐药；恩替卡韦耐药 Selection and clearance of entecavirresistant HBV strains in lamivudineresistant hepatitis B patient treated with entecavir：A case report. MAO Ri cheng， ZHANG Ji ming， YIN You kuan, QIN Yanli， ZHANG Wan qin， ZHANG Qin bo， WU Xiang hui， WENG Xin hua.Department of Infectious Diseases， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040, China 【Abstract】ObjectiveBackgrounds & Aims: Entecavir resistant strains were selected in a lamivudineresistant hepatitis B patient during entecavir monotherapy. The entecavirresistant strains afterward disappeared spontaneously and HBeAg seroconversion occurred while entecavir therapy continued. The evolution of the viral quasispecies of the patient was analyzed. MethodsA series of blood samples and clinical data of the patient were collected. PCR Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) 、clonal analysis and DNA sequencing methods were used to examine the evolution of HBV populations in serum samples. ResultsThe patient had preexisting lamivudineresistant mutants(rtL 【Key words】Hepatitis B virus; Chronic hepatitis B; Entecavir resistant; Lamivudine resistant 恩替卡韦（entecavir, ETV）已被美国FDA和我国SFDA批准用于治疗慢性乙型肝炎。对于未使用过核苷类药物治疗的患者，用ETV治疗能够取得较好的组织学改善，较大的HBV DNA下降幅度以及较高的转氨酶复常率［1,2］。而且，对未使用过核苷类药物的患者，使用ETV治疗2年耐药率为0［3］但是，使用拉米夫定(LAM)治疗无效而换用ETV的患者中，可出现HBV对ETV的耐药，1年的耐药率为7%,2年为16%［4］。本文报告1例LAM耐药患者，在接受ETV治疗过程中出现ETV耐药株，继续治疗后耐药株自动消失，并发生HBeAg血清学转换。同时，我们对该例患者HBV耐药株的动态变化进行了系统研究。 材 料 与 方 法 一、病例 患者，男，46岁，确诊为HBeAg阳性慢性乙型肝炎7年，无乙型肝炎家族史。患者于2001年7月开始使用LAM抗病毒治疗(见图1)（图略），治疗前HBV DNA水平为2×107拷贝/mL，抗病毒治疗一度有效，ALT复常，HBV DNA水平最低曾降至3×104拷贝/mL。LAM治疗80周后，HBV DNA水平开始逐渐升高，随后出现ALT反跳，在治疗96周时达到2×106拷贝/mL。 图1(略) 此后患者自行停用LAM 1个月，又隐瞒病史参加一项ETV临床试验，从2003年8月开始接受ETV 0.5 mg/d治疗，治疗前HBV DNA水平为2.97×108拷贝/mL。ETV治疗后患者HBV DNA水平逐渐下降，治疗84周时, HBV DNA水平降至最低点,为850 拷贝/mL，但治疗96周时，患者的HBV DNA水平开始逐渐升高，将ETV每日剂量增加至1.0 mg/d后，患者的HBV DNA水平并未降低，且呈现逐步上升趋势,在治疗128周时，患者HBV DNA水平已升至458 000拷贝/mL，并且出现ALT反弹，耐药基因检测发现该患者出现ETV耐药相关性变异。在继续用ETV治疗后，HBV DNA水平又出现下降，至144周时，HBV DNA水平降至3 200拷贝/mL；治疗至152周时，HBV DNA水平转阴（套式PCR方法不能测出），ALT复常，并出现HBeAg血清学转换。目前该患者仍在服用ETV。 二、标本 收集患者在ETV治疗基线（0周）、24、48、96、128、144和152周时的系列血清标本，于 三、血清学、HBV DNA及生化学检测 HBV血清学标志物检测采用Abbott试剂，HBV DNA检测采用Amplicor定量PCR检测试剂盒（罗氏诊断试剂）。患者在使用ETV治疗之前同时进行了抗HAV IgM、抗HEV IgM和抗HCV检测，排除了其他病毒感染可能。肝功能检测在我院医学检验中心进行。 四、血清HBV DNA的抽提、YMDD变异及其比例的检测 HBV DNA抽提采用Qiagen GmbH公司试剂盒，操作按说明书进行。YMDD变异及其比例的检测采用限制性片段长度多态性(RFLP)分析方法。根据HBV P基因的保守区序列，设计两对引物，使扩增的核苷酸片段覆盖HBV聚合酶基因的部分RT区（包括B-D基序），引物由上海英俊生物技术公司合成（见表1）（略）。PCR扩增的第1轮上游和下游引物分别为RTS1和RTAS1，第2轮PCR采用上游引物YNSspI和下游引物PAS引入YIDD变异的酶切位点；第2轮PCR采用上游引物PS1和下游引物TMApaL引入YVDD变异的酶切位点。PCR扩增条件均为： 五、血清HBV DNA的PCR扩增、克隆及测序 再设计两对引物，使扩增的核苷酸片段覆盖HBV聚合酶基因的RT区A-E基序，引物由上海英俊生物技术公司合成（见表1）（略）。以上述7个时间点的血清HBV DNA为模板进行PCR扩增，第1轮上游和下游引物分别为RTS1和RTAS1，第2轮PCR上游和下游引物为RTS2和RTAS2。PCR扩增条件同上。PCR产物经胶回收、纯化后直接测序（上海华舜生物工程有限公司生产的胶回收试剂盒），同时采用PMD18-T Vector TA克隆试剂盒（宝生物工程有限公司），将上述回收的PCR产物插入PMD18－T 载体，筛选含目的片段的克隆。每个时间点挑取20～30个阳性克隆，质粒鉴定采用SacI和PstI双酶切（Takara公司）及测序（上海英俊生物技术有限公司）。核苷酸及氨基酸序列分析采用Vector NTI 9.0软件。 结 果 一、血清学检测 ETV治疗前HBeAg阳性，抗-HBe阴性。发生耐药后继续应用ETV治疗，半年后HBeAg转为阴性，抗-HBe阳性，HBV DNA阴性，提示HBeAg发生血清学转换。 二、HBV DNA、ALT的动态变化和血清HBV DNA 序列分析 选取患者在ETV治疗前及治疗后7个时间点的血清标本进行PCR扩增及PCR产物直接测序分析，发现在ETV治疗前患者血清中以YMDD变异株（rtL 三、PCR-RFLP检测YMDD变异株及比例 ETV治疗前的血清标本中只检测到YVDD变异株；治疗24周时的标本中只检测到野毒株；治疗48周时的标本中又出现YMDD变异株，以YIDD变异株为主，还含有野毒株和YVDD变异株；治疗96周时的变异株类型和所占比例与48周时类似；治疗至128周时，YMDD变异类型发生变化，以YVDD变异为主，同时含有野毒株和YIDD变异株；治疗至144周时，病毒群的组成又发生变化，野毒株比例增加，多于YIDD变异株和YVDD变异株；治疗152周时，HBV DNA转阴。 四、 HBV变异株的动态变化 应用克隆技术分析患者各时间点病毒群的构成比，发现基线时LAM耐药株比例高达100%，而且均为rtL 讨 论 目前报道的ETV耐药均发生在LAM治疗失效或有YMDD变异的患者中，对于初治的患者，ETV治疗2年尚未发现ETV耐药相关性变异［3］。 由于ETV耐药相关性变异多发生在LAM治疗失效或有YMDD变异的患者中,且ETV耐药株除了含ETV耐药相关性变异之外，必须同时存在YMDD变异，提示发生ETV耐药的前提可能是先出现YMDD变异株，再以YMDD变异为基础，选择出ETV耐药相关性变异。本文通过对HBV耐药株动态观察证实，在长期ETV治疗过程中，在rtT 由于ETV对YMDD变异株的作用比野毒株药弱20～30倍［4］，因而临床上对LAM耐药患者的治疗剂量通常为1 mg/d。本例患者在ETV剂量增加至1 mg/d后，HBV DNA水平也未下降，HBV病毒群仍以YMDD变异株为主，表明ETV 1 mg/d的剂量并不能完全抑制YMDD变异株，这样就有发生ETV耐药的可能。ETV治疗后128周的克隆中有3个rtL 有研究表明，并不是所有恩替卡韦耐药相关性变异株（T184、S202、M250）都对ETV的敏感性下降，只有那些在YVDD变异基础上（而不是在YIDD变异基础上）同时合并恩替卡韦耐药相关性变异的毒株才表现对ETV敏感性下降。本文中该患者在rtT 参 考 文 献 1Chang TT, Gish RG, de Man R,et al. A comparison of entecavir and lamivudine for HBeAg positive chronic hepatitis B. N Engl J Med, 2006，354∶1001-1010. 2Lai CL, Shouval D, Lok AS, et al. Entecavir versus lamivudine for patients with HBeAg negative chronic hepatitis B. N Engl J Med, 2006，354∶1011-1020. 3Tenney DJ, Levine SM, Rose RE, et al. Clinical emergence of entecavirresistant hepatitis B virus requires additional substitutions in virus already resistant to lamivudine. Antimicrob Agents Chemother. 2004，48∶3498-3507. 4Levine S, Hernandez D, Yamanaka G, et al. Efficacies of entecavir against lamivudine resistant hepatitis B virus replication and recombinant polymerases in vitro. Antimicrob Agents Chemother，2002，46:2525-2532. |