【摘要】目的观察以腺相关病毒（AAV）为载体含有针对金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）-1具有较强抑制作用的小干扰RNA（siRNA）感染大鼠星状细胞系HSC-T6后TIMP-1及基质金属蛋白酶13（MMP13）的表达情况。方法将对大鼠TIMP-1基因具有最强抑制作用的一对siRNA，在体外构建为短发夹siRNA表达载体后，将其包装为重组AAV－ rAAV/siRNA－TIMP－1/neo并感染HSC－T6，于感染后4周及12周应用荧光定量PCR方法及Western blot 方法分别检测TIMP－1及MMP13 mRNA及蛋白质表达情况。结果经PCR、酶切及序列测定证实抑制作用最强的1对siRNA在体外构建的shRNA表达载体成功克隆。将重组质粒包装成病毒后感染HSC－T6细胞，与对照组细胞相比，rAAV/siRNA－TIMP－1/neo感染组在感染后4周及12周细胞TIMP-1 mRNA及蛋白质表达水平明显降低（P<0.01），而MMP13 mRNA及蛋白质表达水平明显增高（P<0.01）。结论化学合成的siRNA在短时期内可有效地抑制TIMP－1基因的表达，重组病毒rAAV/siRNA－TIMP－1/neo可长期有效地抑制TIMP－1基因表达。 【关键词】金属蛋白酶组织抑制因子; 小干扰RNA; 腺相关病毒； 肝星状细胞 Expression of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and matrix metalloproteinase 【Abstract】ObjectiveTo construct recombinant adeno associated virus (AAV) carrying small interfering RNA(siRNA) of tissue inhibitor of metalloproteinase1(TIMP－1) and investigate the long term effect of TIMP－1 gene RNA interference on rat hepatic stellate cell(HSC)-T6 cells and the influence on the expression of matrix metalloproteinase(MMP) 【Key words】Tissue inhibitor of metalloproteinase-1; Small interfering RNA; Adeno associated virus; Hepatic stellate cell 肝纤维化是指肝脏内弥漫性纤维结缔组织沉积，它是许多慢性肝脏疾病的共同病理过程，是发展到肝硬化的必经之路。目前认为肝脏细胞外基质的合成与降解失衡，导致其在肝内过度沉积是肝纤维化发展的主要机制。在细胞外基质降解过程中起主要作用的为基质金属蛋白酶（MMPs）,而其活性可被金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）所抑制，其中TIMP－1在肝纤维化过程中对基质金属蛋白酶的活性抑制作用较家族中其他成员作用要强［1］。近年有研究表明,激活的肝星状细胞(HSC)可使TIMP－1表达增强,而TIMP－1的相对增加,使得肝脏细胞外基质不能被MMPs及时降解造成堆积,导致了肝纤维化直至肝硬化的发生。因而抑制HSC的TIMP－1基因表达可以作为一种防治肝纤维化的方法。 小干扰RNA(siRNA)可以高效率、特异地阻断体内同源基因表达，促使同源mRNA降解，诱导细胞表现出特异基因缺失的表型。RNA干扰(RNAi)技术比基因敲除技术更方便快捷地显示出基因的功能,它通过引入双链RNA引发转录后基因沉默，从而成为一种抑制细胞中某个基因表达的工具，已成为分子生物学领域最热门的研究课题之一。短发夹siRNA表达载体系统利用其带有抗生素标记的特性可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。将病毒载体用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。本室前期工作［2］已针对肝纤维化关键基因TIMP－1 mRNA,化学合成5对siRNA,观察其在转染大鼠肝星状细胞系HSC－T6后TIMP-1基因表达的抑制作用，最终筛选出对HSC－T6的TIMP－1表达抑制作用最强的一对siRNA。本研究目的是将对大鼠TIMP－1具有较强抑制作用的siRNA重组构建表达载体并将其至腺相关病毒(AAV)中，观察此重组AAV感染大鼠HSC－T6后TIMP－1的表达抑制作用，同时对其直接抑制底物MMP13的表达进行了检测，为今后基于TIMP－1的抗纤维化治疗提供一定的实验基础。 材 料 与 方 法 一、实验材料 大鼠HSC－T6细胞株由美国Fridman教授惠赠, Trizol、 RNase－free DNase I、 RT－PCR反应试剂盒购自美国Promega公司， Taq -platinum 聚合酶、PCR产物纯化回收试剂盒及pGMT－vector购自北京天为时代公司。RT－PCR引物、荧光定量PCR引物及Taqman荧光探针均由北京赛百盛公司合成。小鼠抗大鼠TIMP－1单克隆抗体购自 R&D 公司，小鼠抗大鼠MMP13单克隆抗体购自 Chemicon公司,小鼠抗大鼠β-actin 单克隆抗体购自Sigma公司。 二、实验方法 (一) HSC－T6 细胞培养及传代HSC－T6细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基置 (二) 分子克隆和TIMP－1基因特异性siRNA表达载体的构建见参考文献3。 (三) 重组病毒的包装及其对HSC－T6的感染rAAV/siRNA－TIMP－1/neo和 rAAV/Neo 病毒均来源于293细胞。分别将5 μg pdl6-95/siRNA-TIMP-1/neo载体质粒及pdl6-95/Neo载体质粒(由美国阿肯萨大学基因治疗中心Hermonat教授惠赠)与5 μg AAV/腺病毒辅助质粒pSH3共转染293细胞，DNase I处理1 h后，病毒溶液经肝磷脂－琼脂糖柱纯化后，经磷酸盐缓冲液洗脱并纯化,最终得到两种病毒，即rAAV/siRNA-TIMP-1/neo 和 rAAV/Neo，两种病毒储液经Dot Blot鉴定，浓度均达到1×108/mL。 (四) 感染后细胞TIMP－1和MMP13基因转录及蛋白表达水平的检测将筛选出具G418抗性的细胞克隆培养4周及12周后，分别提取其RNA及蛋白，以检测病毒感染后细胞TIMP－1和MMP13基因转录及蛋白表达水平。 将阳性细胞克隆培养4周及12周的培养上清液弃去后，加入Trizol以获取总RNA，将其逆转录为cDNA后，根据本室建立的检测TIMP－1基因的荧光定量PCR方法［4,5］，以合成后的cDNA作为模板，进行荧光定量PCR。同时根据本室建立的检测MMP13的相对荧光定量PCR方法，反应体系与TIMP-1基因的荧光定量PCR反应体系相同，只是其中上下游引物分别替换为MMP13特异性引物，上游引物：5′－GGAAG-ACCCTCTTCTTCTCA－3′，下游引物：5′－TCATAGACAG－CATCTACTTTGTC－3′，反应条件同于TIMP-1基因扩增反应。 分别收集感染后4周及12周细胞,用PBS漂洗3次,离心,弃上清液,加50μl蛋白质裂解液,冰浴20 min， 三、统计学处理 结果数据以±s 表示,采用SPSS 13.0 统计软件对实验数据进行统计处理,行方差分析。结 果 一、TIMP－1基因特异性siRNA表达载体的构建经PCR、酶切及序列测定证实抑制作用最强的一对siRNA在体外构建的shRNA表达载体成功克隆［3］。因为小鼠RNA 聚合酶Ⅲ终止识别6个T,在2个T处终止,小鼠U6 snRNA 启动子体内转录的shRNA会折叠形成3′端2个U突出的茎部21 bp 环为9 bp 的短发夹环,从而有效模拟RNAi过程中间体。 二、重组病毒感染HSC－T6后基因转录水平的检测 分别提取转染后4周及12周细胞的RNA，将其逆转录为cDNA后，根据本室建立的检测TIMP－1基因的荧光定量PCR方法进行扩增，同时用GAPDH作为内参，检测转染后不同时期TIMP－1基因的转录情况（见图1）（略）。荧光定量PCR结果显示感染重组病毒后4周, rAAV/siRNA－TIMP－1/neo感染组细胞中TIMP－1 mRNA的相对转录水平为(0.1 526±0.0 871)，即TIMP－1拷贝数/μg RNA与β－actin拷贝数/μg RNA之比值，而感染rAAV/neo 组及正常HSC细胞中TIMP－1 mRNA的相对转录水平分别为(0.7 488±0.2 271)和(0.9 586±0.1 906)，前者与后两者相比，mRNA水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。感染重组病毒后12周, rAAV/siRNA－TIMP－1/neo感染组细胞中TIMP-1 mRNA的相对转录水平为(0.1 174±0.0 315)，而rAAV/neo感染组及正常HSC细胞中TIMP-1 mRNA的相对转录水平分别为(0.8 238±0.094)和(0.9 586±0.1 906)，前者与后两者相比，mRNA水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。应用相对荧光定量PCR方法证实，在感染重组病毒后4周及12周，与rAAV/neo感染组及正常HSC细胞相比，rAAV/siRNA－TIMP－1/neo感染组细胞中MMP13 mRNA的相对转录水平显著增高，差异有统计学意义（P<0.01）（见图2）。（略） 三、重组病毒感染HSC-T6后蛋白表达水平的检测 检测感染后不同时期TIMP-1基因的表达情况（见图3）（略）。结果显示，感染重组病毒后4周，rAAV/siRNA－TIMP－1/neo感染组细胞中TIMP－1的表达水平较感染 rAAV/neo 组及正常HSC约降低60％；感染重组病毒后12周，rAAV/siRNA－TIMP－1/neo感染组细胞中TIMP－1的表达几乎下降90％。同时，在感染重组病毒后4周及12周，rAAV/siRNA－TIMP－1/neo感染组细胞中MMP13的表达水平较rAAV/neo感染组及正常HSC均明显增高，差异有统计学意义（P<0.01）（见图4）（略）。 以往研究显示，活化的HSC能表达TIMP－1，TIMP－1过度表达能增加实验性肝纤维化程度［6］。因此，如能抑制TIMP－1的高表达，将解除其对MMPs的抑制作用，增加MMPs的活性，从而有助于降解过多沉积在肝脏中的细胞外基质。siRNA可以高效率、特异地阻断体内同源基因表达，促使同源mRNA降解，诱导细胞表现出特异基因缺失的表型。目前可以在实验室中制备siRNAs的操作方法主要有化学合成、体外转录、重组Dicer酶途径、shRNA表达载体系统和PCR制备的shRNA表达框在细胞中表达等5种方法。shRNA表达载体的优点是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。shRNA表达载体包括质粒表达载体和病毒载体，多数的shRNA表达载体使用3种RNA聚合酶Ⅲ (Pol Ⅲ)启动子中的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。产生的这种shRNA分子包含两段短的反向重复序列，其中一个反向重复序列与目的基因互补，中间间隔一个小的茎环序列。shRNA分子随后被加工成siRNA分子，降解目的基因mRNA并抑制其表达。本研究前期工作［2］利用Ambion公司提供的在线设计工具选择了TIMP－1 cDNA序列中的5段靶序列合成5对siRNA，将这5对siRNA分别转染HSC－T6细胞，分别检测转染后24 h、48 h及72 h HSC-T6细胞中TIMP-1的表达情况。Western blot结果显示，合成的5对siRNA中有3对在转染后48 h显示出对TIMP-1基因表达较强的抑制作用，但转染后72 h合成的5对siRNA转染细胞与对照组细胞相比，TIMP-1表达水平没有显著差异。为实现siRNA长期作用的效果，我们挑选其中抑制作用最强的-对siRNA构建了siRNA－TIMP－1真核表达载体，并利用鼠源U6启动子指导siRNA-TIMP-1编码序列的转录，然后以Pol Ⅲ所识别的终止信号终止转录，符合shRNA表达载体的要求［7，8］。 作为病毒载体，AAV克服了其他载体所具有的感染细胞类型的限制以及由于随机整合而存在的潜在致病性的缺点，今年来其在基因治疗中的用途已日渐受到人们的关注。AAV的显著优点在于：（1）可以感染分裂细胞及非分裂细胞；（2）宿主细胞范围广泛；（3）迄今为止未见任何其致病性报道，且在感染细胞中不能复制；（4）可以稳定整合至宿主细胞基因组DNA中，通常为19号染色体，从而实现稳定外源基因表达［9］。本文在已有的AAV载体质粒（仅含有两端末端重复序列）—pdl6－95/neo基础上成功构建了含有siRNA－TIMP－1的重组质粒pdl6－95/siRNA－TIMP－1/neo，然后将其包装为病毒rAAV/siRNA－TIMP－1/neo并与空载体病毒rAAV/neo同时感染HSC－T6。由于我们构建的载体上带有新霉素基因，对转染的HSC－T6细胞进行G418压力筛选，通过此方法获得了稳定整合有pdl6－95/siRNA－TIMP－1/neo和pdl6-95/neo基因的单细胞来源的细胞克隆。在重组病毒感染后的4周及12周，提取感染细胞的RNA及蛋白，分别检测转染后细胞TIMP－1基因转录及蛋白表达情况。荧光定量PCR及Western blot结果显示，rAAV/siRNA－TIMP－1/neo感染组细胞与rAAV/neo感染组及正常HSC细胞相比，在感染后4周及12周，TIMP－1 mRNA的相对转录水平及蛋白质表达水平均显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。此外，rAAV/siRNA－TIMP－1/neo感染组细胞与rAAV/neo感染组及正常HSC细胞相比，在感染后4周，TIMP－1的表达水平约降低60%，感染后12周，TIMP－1的表达几乎降低90％，此现象与病毒载体的作用原理相符。以AAV为载体的感染技术除具有可与宿主细胞DNA发生定点整合的特点外,其在感染后不同时期,病毒表达丰度具有差异,感染后2个月左右,其表达丰度可达一峰值［10］,因而在rAAV/siRNA－TIMP－1/neo感染后12周, TIMP－1基因的表达被强烈抑制。为进一步确认siRNA所发挥的抑制TIMP－1表达的作用，我们同时对TIMP－1的主要作用底物——MMP13进行了检测。荧光定量PCR及Western blot结果显示，rAAV/siRNA-TIMP－1/neo感染组细胞与rAAV/neo感染组及正常HSC细胞相比，在感染后4周及12周，MMP13 mRNA的相对转录水平及蛋白质表达水平均显著增高，差异也具有统计学意义（P<0.01）。典型的外源合成的siRNAs的转染在3 d以内会从mRNA抑制中恢复，然而用siRNA表达载体转染的细胞将经历稳定的、长期的mRNA的抑制作用,尤其采用AAV载体所具有的无致病性、可与宿主细胞基因组DNA发生定点整合等特性，使得以AAV为表达shRNA载体在体内产生siRNA成为了比转染化学合成的siRNA更经济有效的方法。我们正在对rAAV/siRNA－TIMP－1/neo感染HSC－T6后对细胞外基质合成的影响进行研究，同时rAAV/siRNA－TIMP－1/neo感染小鼠的体内实验也在进行中。 参 考 文 献 1Brew K, Dinakarpandian D, Nagase H. Tissue inhibitors of metalloproteinase: evolution , structure and function. Biochim Biophys Acta ,2000 , 1477∶267－283. 2丛敏，王萍，刘天会，等.小干扰RNA对肝星状细胞基质金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的抑制作用.首都医科大学学报，2006，27∶767－770. 3丛敏，王萍，刘天会，等.反义及小干扰RNA对大鼠肝星状细胞基质金属蛋白酶组织抑制因子1表达的抑制作用.中华肝脏病杂志，2006，14∶742－747. 4丛敏，阎钟钰，王萍，等.荧光定量聚合酶链反应检测金属蛋白酶组织抑制因子-1方法的建立.中华检验医学杂志，2005，28∶533－537. 5王萍，丛敏，阎钟钰，等.Taqman荧光定量PCR是核酸水平对管家基因GAPDH进行定量的好方法.首都医科大学学报，2006，27∶210－213. 6Yoshiji H, Kuriyama S, Miyamoto Y, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinases-1 promotes liver fibrosis development in a transgenic mouse model. Hepatology, 2000, 32∶ 1248－1254. 7Sui G, Soohoo C, Affar EB, et al. A DNA vector based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc Acad Sci USA, 2002, 99∶5515－5520. 8Yu JY, DeRuiter SL， Turner DL. RNA interference by expression of short interfering RNAs and hairpin in mammalian cells. Proc Acad Sci USA, 2002, 99∶6047－6052. 9Stilwell JL， Samulski RJ. Adenoassociated virus vectors for therapeutic gene transfer. Biotechniques, 2003,34∶148－154. 10Mochizuki S, Mizukami H, Ogura T, et al. Long term correction of hyperphenylalaninemia by AAV mediated gene transfer leads to behavioral recovery in phenylketonuria mice. Gene Ther， 2004， 11∶1081－1086. |