近年来随着人们饮食结构和生活方式的改变，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发病率不断上升，其防治工作面临重大挑战，临床治疗至今缺乏特效药物［1］。研究表明，游离脂肪酸（FFA）的增多及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和瘦素（Leptin）的异常表达在NASH的发病机制中可能起着重要作用［2-5］。本研究旨在通过观察肝宝胶囊对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠血清生化影响及其与肝脏病理损害的关系，探讨其治疗NASH的可能作用机制。材料与方法 一、主要材料 实验动物为健康雄性SD大鼠60只，清洁级，体重为200～230 g，购于浙江大学动物实验中心。中药复方肝宝胶囊（由青果、虎杖等中药组成，福州市中西医结合肝病研究所生产，批号:030301）每粒0.45 g（相当于生药8.75 g）；东宝肝泰片由通化东宝药业股份有限公司生产，批号:20010209。TNF-α、Leptin和空服胰岛素(FIns)试剂盒由解放军总医院科技开发中心放免所提供；空腹血糖(FBG)试剂盒由华西糖尿病科技开发研究所提供；甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-c)、ALT、AST、FFA、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒由南京建成生物医学研究所提供。TGL-16G低温高速离心机购自上海安亭仪器厂, HH6恒温水浴箱购自常州国华电器有限公司, FJ2008PSγ放射免疫计数器购自西安二六二厂，全自动生化分析仪购自意大利。 二、方法 （一）大鼠NASH模型的建立及给药方法大鼠适应性喂养1周，随机分为6组，即空白组（正常组）、模型组、东宝肝泰治疗对照组（简称对照组）、肝宝胶囊低剂量治疗组（简称低剂量组）、肝宝胶囊中剂量治疗组（简称中剂量组）、肝宝胶囊高剂量治疗组（简称高剂量组）。参考文献［6］建立高脂饮食性脂肪肝模型，即在82.5%基础饲料基础上加10％猪油、5％蛋黄粉、2％胆固醇、0.5％胆酸钠。除正常组普通饲料喂养外，其余5组均采用高脂饲料喂养造模法。给药方法：正常及模型对照组不给药；肝宝胶囊小、中、高剂量治疗组自造模开始即灌胃给药，给药量分别为5 g·kg-1·d-1、10 g·kg-1·d-1、20 g·kg-1·d-1；东宝肝泰治疗组以0.54 g·kg-1·d-1灌胃。体积均按1 ml/100 g计算。共执行8周。 （二） 血清标本采集及检测实验后8周末最后一次给药禁食12 h后称重，腹腔麻醉、腹主动脉采血8 ml，在低温下3 000×g离心10 min，分离血清置于-20℃冰箱中1周内检测。ALT、AST、TG、TC、HDL-c、FBG的测定用全自动生化分析仪由专人按说明书操作。FFA、MDA、SOD的测定采用生化法，TNF-α、Leptin、FIns的测定采用免疫放射法。 （三） ISI计算方法ISI等于空腹血糖与空腹胰岛素乘积的倒数的自然对数。 （四） 病理标本采集及观测在肝脏最大叶边缘5 mm处取小块肝组织，用10%甲醛溶液固定。常规脱水，浸蜡，包埋，制成蜡头，5 μm切片，HE染色，在光镜下观察肝小叶结构、肝细胞变化及炎症细胞浸润等病理变化情况。 三、统计学处理 所有数据均以±s表示。所有操作均在SPSS 11.5软件上进行。 结果 一、肝宝胶囊对肝脏组织病理学改变的影响 正常组：大鼠肝小叶结构完整，肝细胞未见明显变性，胞质中未见脂滴。模型组：大鼠肝小叶结构尚存在，肝细胞弥漫性浊肿脂变，并有大灶性坏死，网纤崩陷和较多慢性炎性细胞浸润和少数中性白血球浸润。对照组：肝小叶结构完整，肝细胞多灶性浊肿，并有少数点灶性坏死，中央静脉周围有少量慢性炎症细胞浸润。低剂量组：肝小叶结构完整，少数肝小叶细胞呈浊肿改变和点灶性坏死，中央静脉周围和坏死区有少量慢性炎症细胞浸润。中剂量组：肝小叶结构完整，少数肝小叶细胞见有点灶性坏死、细胞呈浊肿改变不明显，中央静脉周围有少量慢性炎症细胞浸润。大剂量组：肝小叶结构完整，肝细胞未见弥漫性病变，但个别小叶见有点灶性坏死。 二、肝宝胶囊对各组大鼠血脂和转氨酶的影响 实验结束时，测量各组大鼠动脉血ALT、AST、TG、TC、HDL-c的含量。结果见表1。与正常组相比，模型组大鼠血清ALT、AST、TG、TC值显著升高，HDL-c显著下降。各药物干预组血清ALT、AST、TG、TC明显下降，HDL-c明显升高；而中、高剂量组血清上述各项生化指标的变化又较对照组明显。 三、肝宝胶囊对各组大鼠血清FFA、TNF-α和Leptin水平的影响 NASH的一个重要特征是血清FFA、TNF-α和Leptin值均非常显著升高。但经中西药干预的各组血清FFA、TNF-α、Leptin值均显著下降。且高、中剂量组血清FFA、TNF-α、Leptin值又显著低于东宝肝泰对照组。见表2。 表1（略）表2（略） 四、肝宝胶囊对各组大鼠FBG、FIns和ISI的影响 NASH的主要特征是存在胰岛素抵抗。表现为血清FBG、FIns值显著升高，ISI值显著下降。表3的结果显示各药物组大鼠血清FBG、FIns值显著降低，而ISI显著升高。对照组相比，高剂量GBC组血清FBG和FIns水平的下降及ISI的上升更明显，显示高剂量GBC减轻胰岛素抵抗（IR）的作用更大。表3（略） 五、肝宝胶囊对各组大鼠血清SOD和MDA的影响 血清SOD值下降、MDA值升高是NASH的另一重要特征。经各药物干预后SOD明显上升，MDA明显下降。高、中剂量肝宝胶囊的上述治疗作用明显优于对照组。见表4。表4（略） 讨论 NASH的发病机制至今仍有许多问题尚未阐明。一般认为NASH的发病与胰岛素抵抗相关［7］。而TNF-α是NAFLD发病的重要介质［8］。高水平的TNF-α可能直接作用于脂肪组织调节瘦素的释放，且TNF-α和瘦素协同作用可诱导胰岛素分泌，从而导致胰岛素抵抗［9］。近年来，多数学者认为Day等［10］提出的“二次打击”学说似可解释NASH复杂的病理机制。但在以氧应激为轴心和在以脂质过氧化为轴心的二次打击中FFA似乎均可起重要作用［11］。FFA除脂肪毒性直接造成肝损害外，还具有内毒素、促炎症因子、肝星状细胞增殖因子、细胞凋亡诱导剂的作用［12］。最近一项临床预研究还表明治疗性空腹FFA和胰岛素水平的降低与NASH患者的肝脂肪变和肝细胞气球样变获得改善独立相关［13］。进一步体内外研究还证实，FFA可诱导溶酶体发生膜渗透，稳定性丧失，使溶酶体内组织蛋白酶B释入细胞液，进而刺激NF-κB依赖性TNF-α表达，增强肝的脂肪毒性［14］。在人类NAFLD肝活检标本中也观察到组织蛋白酶B从溶酶体中释入细胞液中并与肝病程度相关。在高脂饮食诱导正常大鼠NAFLD模型中不论采用基因或药物的方法灭活组织蛋白酶B均能防止肝脂肪变、肝损伤及代谢综合征相关性胰岛素抵抗。此外抗氧化防御机制的障碍也是NASH发病机制中的一个重要因素［15］。本研究显示，通过高脂食料复制的NASH动物模型中，模型组大鼠血清FFA 、TNF-α、Leptin、FBS、Fins、MDA及血脂水平显著升高，SOD含量显著下降，ISI值也明显下降，肝组织明显损伤。但是与模型组相比，经药物干预后，特别是肝宝胶囊各治疗组大鼠血清FFA、Leptin 和TNF-α值均有显著降低，并呈剂量依赖关系；血清FBG和FIns水平明显下降，ISI值升高；血清SOD含量显著升高，MDA含量则明显下降；同时血脂、肝功能和肝组织病变也获明显改善。而中、高剂量肝宝胶囊的上述治疗作用明显优于东宝肝泰。提示肝宝胶囊治疗NASH的机制与降低FFA、TNF-α、Leptin和血脂含量，提高机体抗氧化能力，减轻IR和肝组织坏死和炎症细胞浸润等密切相关。推测肝宝胶囊治疗NASH的机制可能是通过多途径、多环节、多靶点的干预作用，达到降低FFA和（或）通过抑制细胞内组织蛋白酶B活性降低TNF-α表达、降脂、减轻IR、增强机体抗氧化能力、改善肝功和恢复肝脏病理损伤的治疗效果。但肝宝胶囊的确切治疗机制特别是其整体调节机制尚有待进一步探讨。 参考文献 1范建高．脂肪性肝病．北京：人民卫生出版社，2005． 2曾民德.脂肪肝——肝病领域的新挑战.中华肝脏病杂志,2000,8∶69. 3徐正婕，范建高，王国良.游离脂肪酸在脂肪性肝炎发病中的作用.中华肝脏病杂志，2000，8∶127-128. 4周亚茹. TNF-α在胰岛素抵抗发生机制中的作用.国外医学免疫学分册，2002，25∶276-279. 5江守芳,高鑫,陆志强,等.肥胖患者中瘦素与胰岛素抵抗的关系.复旦大学(医学版),2002,29∶290-293. 6钟岚，范建高，王国良.非酒精性脂肪肝动物模型.国外医学消化系疾病分册，1999，19∶175-178. 7Choudhury J, Sanyal AJ. Insulin resistance in NASH. Front Biosci， 2005，10∶1520-1533. 8Diehl AM. Tumor necrosis factor and its potential role in insulin resistance and nonalcoholic fatty liver disease. Clin Liver Dis， 2004，8∶619-638. 9孙琦，杨国华，王. 肿瘤坏死因子α和瘦素在肥胖及胰岛素抵抗中的作用. 中华内科杂志，2005，7∶514-517. 10Day CP,James OF.Steatohepatitis：a tale of two“hits“? Gastroenterology， 1998，114∶842-845. 11Te Sligte K, Bourass I, Sels JP, et al. Nonalcoholic steatohepatitis: review of a growing medical problem. Eur J Intern Med. 2004，15∶10-21. 12曾民德.葡萄糖毒性、脂肪毒性与非酒精性脂肪性肝病.中华肝脏病杂志，2005，2∶81-82. 13Sanyal AJ, Mofrad PS, Contos MJ, et al. A pilot study of vitamin E versus vitamin E and pioglitazone for the treatment of nonalcoholic steatohepatitis. Clin Gastroenterol Hepatol， 2004，2∶1107-1115. 14eldstein AE, Werneburg NW, Canbay A, et al. Free Fatty Acids Promote Hepatic Lipotoxicity by Stimulating TNF-α Expression via a Lysosomal Pathway. Hepatology. 2004,40∶185-194. 15Koruk M, Taysi S, Savas MC, et al. Oxidative stress and enzymatic antioxidant status in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Ann Clin Lab Sci， 2004，34∶57-62. 上海《肝脏》杂志社版权 |